文献分享 | Adv. Mater. | 一种多通道Ca2+纳米调节剂用于多级线粒体损伤介导的癌症治疗

今天分享一篇2021年3月份发表在 Adv. Mater. 上的文章，该文的通讯作者是中国科学院长春应化所的丁建勋研究员。丁建勋研究员的主要研究领域是生物响应可降解高分子的可控合成及其生物医学应用。文章的第一作者是Pan Zheng。

线粒体作为哺乳动物细胞的动力和能量提供者，不仅对细胞生存和增殖至关重要，而且还负责一系列信号传递过程。通常，线粒体中的结合钙和游离钙维持在一个动态平衡。当游离Ca²⁺水平显著增加时，线粒体内Ca²⁺的释放受到干扰，导致细胞凋亡。癌细胞比健康细胞对Ca²⁺浓度的升高更敏感。因此，调节线粒体内Ca²⁺浓度可能是一种精确癌症治疗的有效策略。然而，目前的Ca²⁺纳米发生器有各种限制。例如，Ca²⁺排出使线粒体内Ca²⁺浓度可以快速恢复到正常水平，导致抗癌效果不理想。

图 1  设计策略。

因此，作者通过简单的一锅法策略，制备了多通道Ca²⁺纳米调节剂CaNM_CUR+CDDP（图1）。在一个密封的容器中，由碳酸氢铵(NH₄HCO₃)分解产生的氨(NH₃)和二氧化碳(CO₂)被连续扩散到含有氯化钙(CaCl₂)、多巴胺(PDA)、顺铂（CUR）和姜黄素（CDDP）的反应溶液中，产生碱性环境，并分别作为碳酸根离子(CO₃^2-)的来源。随后，以原位合成的聚多巴胺(PDA)为模板，顺铂(CDDP)和姜黄素(CUR)共掺杂到CaCO₃纳米粒子中，成功制备了多通道Ca²⁺纳米调节剂(CaNM_CUR+CDDP)。CaNM_CUR+CDDP可通过以下协同机制实现多级线粒体损伤:首先，CaCO₃组分释放大量Ca²⁺，导致线粒体内Ca²⁺超载；其次，释放的CUR进一步促进Ca²⁺从内质网释放到细胞质，并抑制Ca²⁺流出；最后，CDDP通过线粒体DNA损伤以及通过线粒体结构和代谢功能的破坏诱导了线粒体功能障碍。同时，CUR和PDA分别使该纳米调节剂具有了荧光和光声成像功能。作者还将mPEG-DMDF用于表面改性，以改善水分散性并延长CaNM_CUR+CDDP的循环半衰期。因此，多功能聚乙二醇化的钙离子纳米调节剂^PEGCaNM_CUR+CDDP是一种很有前途的靶向治疗癌症的细胞器纳米平台。

图 2  Ca²⁺纳米调节剂的性质。（a）CaNM_CUR+CDDP、CaNM_CUR、CaNM_CDDP和CaNM的TEM图。（b）CaNM_CUR+CDDP的元素映射。（c）流体动力直径。（d）UV-Vis吸收光谱。（e）各种Ca^{2 +}纳米调节剂的TGA曲线。

接下来，作者对该纳米调节剂的一些基本性质进行了研究，作者同时合成了四种纳米颗粒，即负载CUR和CDDP的CaNM_CUR+CDDP，单负载药物纳米颗粒CaNM_CUR和CaNM_CDDP以及单纯的CaCO₃纳米颗粒CaNM。透射电子显微镜(TEM)成像显示，所有获得的样品都是单分散的球形纳米颗粒，都是具有CaCO₃非晶结构的单分散球形纳米颗粒。透射电子显微镜检测到的CaNM_CUR+CDDP、CaNM_CUR、CaNM_CDDP和CaNM直径分别约为211、198、127和121 nm。动态激光散射测量与这些结果一致（图2C）。CaNM_CUR+CDDP中CUR和CDDP的成功加载进一步通过元素图谱中Pt的存在(图2B)、紫外-可见光(UV-VIS)吸收光谱中427 nm处CUR峰的出现所证实(图2D)，X光中的铂4f峰光电子能谱和热重分析结果中的比例质量减少(图2E)。这些结果证明了负载了CUR和CDDP两种药物的纳米调节剂的成功制备。

图 3  细胞吸收，细胞内Ca²⁺浓度和体外细胞毒性。（a）^PEGCaNM_CUR+CDDP、^PEGCaNM_CUR和CUR的荧光图像。（b）FCM图像。（c）细胞内Ca²⁺产生的CLSM图像。（d）线粒体Ca²⁺浓度数据输出图。（e）MTT实验。

图 4  Ca²⁺稳态的破坏，细胞色素C和Casspase-3的表达。（a）用^PEGCaNM_CUR+CDDP或其他Ca²⁺纳米调节剂使用的MCF-7细胞的线粒体膜电位荧光图像。（b）用^PEGCaNM_CUR+CDDP治疗前后MCF-7细胞的生物TEM图像。（c）在MCF-7细胞中的细胞色素C、Caspase-3和裂解的Caspase-3的表达。

为了进一步验证这些结果，作者通过用JC-1染色来评估不同处理后的MCF-7细胞的线粒体膜电位。用不同Ca²⁺纳米调节剂处理的所有细胞显示出比对照细胞更低的线粒体膜电位。用^PEGCaNM_CUR+CDDP处理的细胞具有最强的绿色荧光强度，表明线粒体膜电位最低，线粒体损伤最严重（图4A）。随后，通过用具有红色荧光的MitoTracker Deep Red FM来研究线粒体的细胞内分布。用Ca²⁺纳米调节剂处理的所有细胞显示出红色荧光分布减少。^PEGCaNM_CUR+CDDP组显示红色荧光最少，表明线粒体数量最少，线粒体损伤最严重。为了进一步可视化线粒体的破坏，获得了不同处理前后MCF-7细胞的生物透射电镜显微图像。用CUR或CDDP处理的MCF-7细胞仅表现出轻微的线粒体破坏，而CUR+CDDP的联合处理诱导了更严重的线粒体破坏。更重要的是，^PEGCaNM_CUR+CDDP导致线粒体破坏最多，线粒体明显肿胀和空泡化，而MCF-7细胞在治疗前的线粒体形态正常(图4B)。此外，通过免疫荧光检测MCF-7细胞中细胞色素C、caspase-3和裂解的caspase-3的表达水平。在与^PEGCaNM_CUR+CDDP共孵育的细胞中，观察到细胞色素C、caspase-3和裂解的caspase-3显著的上调(图4C)。与这些结果一致，蛋白质印迹分析也证明了与^PEGCaNM_CUR+CDDP共孵育的细胞中细胞色素C和裂解的caspase-3蛋白的强烈上调。因此，^PEGCaNM_CUR+CDDP最有效地上调凋亡相关蛋白和基因，这归因于基于双重治疗促进的Ca²⁺超载的多水平线粒体损伤，导致最高水平的细胞凋亡。

图 6 ^PEGCaNM_CUR+CDDP的体内抗癌效果。(a）治疗时间表。(b）肿瘤生长曲线。(c）小鼠体重变化。(d）治疗结束后，MCF-7肿瘤裸鼠收集的H＆E-和TUNEL染色的肿瘤活组织检查。

^PEGCaNM_CUR+CDDP优化的药代动力学、增强的肿瘤积累和良好的荧光和光声成像能力使作者使用MCF-7荷瘤裸鼠模型进行抗癌评估。为了证明^PEGCaNM_CUR+CDDP的治疗效果，作者将^PEGCaNM_CUR+CDDP的剂量减半，而所有的游离药物都以其正常剂量给药 (图6A)。

MCF-7荷瘤裸鼠在治疗过程中肿瘤体积和体重的变化见图6B、C。除对照组外，其余各组均观察到治疗效果。即使给药剂量为游离药物的一半，^PEGCaNM_CUR+CDDP仍能产生最小的肿瘤体积，这归因于其诱导多级线粒体损伤的能力。此外，CUR+CDDP和CDDP导致严重的全身毒性，CUR+CDDP组没有幸存者，CDDP组在治疗后只有一只小鼠存活。相反，^PEGCaNM_CUR+CDDP表现出较低的全身毒性，因为其肿瘤内蓄积是由于EPR效应和对酸性条件的选择性细胞内药物释放。为了进一步证实^PEGCaNM_CUR+CDDP的增强治疗效果，对肿瘤组织切片进行了进行苏木精和曙红（H＆E）和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色（图6D）。如预期的那样，^PEGCaNM_CUR+CDDP诱导的细胞凋亡最多，染色质凝集和细胞皱缩通过H＆E染色可见。与其他Ca²⁺纳米调节剂相比，^PEGCaNM_CUR+CDDP导致更大的肿瘤组织坏死面积。所有这些数据表明，^PEGCaNM_CUR+CDDP多功能Ca²⁺纳米调节剂可诱导双重治疗促进的Ca²⁺超负荷和线粒体多水平损伤，因此作为一种有效的癌症治疗方法具有潜在的应用前景。

综上所述，作者通过简单的一锅法和气体扩散程序成功地制备了结合有CaNM_CUR+CDDP的双重疗法，用作双重疗法促进的Ca²⁺超负荷为主的癌症疗法，诱导了多水平的线粒体损伤。在相同的密封容器中同时制备其他Ca²⁺纳米调节剂，用作对照。通过进一步的表面修饰，获得的^PEGCaNM_CUR+CDDP表现出改善的水溶性，延长的血液循环和增强的肿瘤内蓄积。全身性给药后，这种细胞内酸度响应性Ca²⁺纳米调节剂可通过Ca²⁺，CDDP和CUR的突然释放有效诱导多水平线粒体损伤。此外，^PEGCaNM_CUR+CDDP是一种有效的治疗制剂，具有增强的抗癌功效，降低的全身毒性以及出色的荧光和PA成像能力。因此，这种经过精确设计的多功能Ca²⁺纳米调节剂在临床实践中具有用于线粒体靶向癌症治疗。

 

作者：王梦其

核稿者：张卫

上传者：苏迪

原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adma.202007426

原文引用：

DOI: 10.1002/adma.202007426