【实验技能知多少】| 细胞培养的细节与问题解答
发布于 2022-05-18 15:43
实验小白在新手村的头号任务，大概逃不开养细胞——养好这些“娇贵”的细胞看似简简单单，实则暗藏玄机。常在实验室中听到的抱怨就是“细胞怎么又污染了/我的细胞又死辽/细胞到底怎么就是长不好…”。虽然流程就寥寥几步，但稍不留神，细胞就会“闹起脾气”。
本系列推送第二篇带大家走进实验室中最常见的操作之一：细胞培养。它也是后续实验的基石。我们将为大家介绍细胞复苏、传代、冻存等一系列步骤中的重要注意点，以及对常见的问题进行解答。
主要步骤与常见问题的解答
1
培养细胞的人工环境
各种细胞的培养条件相差很大，但是培养细胞的人工环境必须包括合适的容器，其中含有一定的基质或培养基，为细胞提供必需的营养物质并调节生理化学环境。
Q&A
Q1：针对不同细胞，细胞培养基配方一样吗？如何获知呢?
A：不同细胞的培养基是不同的。一般ATCC购买的细胞，针对不同细胞株，会有详细介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源乳腺癌细胞MCF-7细胞一般为1640，人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基。
Q2：细胞培养时能否更换培养基种类？
A：首先得确定现在用的培养基是否适合你的细胞生长。细胞培养过程中，细胞增殖和形态正常的情况下最好不要更换培养基，细胞都有各自适应的培养基，更换培养条件，细胞可能无法快速适应，导致细胞死亡。若必须更换，可尝试半换，让细胞逐渐适应新的培养基。
Q3：培养细胞什么时候需要换液？
A：视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。
Q4：细胞培养板规格不一，如何正确选用?
A：根据不同规格的细胞培养皿/板容量及用途，如流式一般用 6 孔，爬片一般用 24 孔，MTT 一般用 96 孔等，具体信息如下图所示：
Q5：培养瓶中应该加入多少体积的培养基？
A：推荐的用量为：T-25培养瓶5ml，T-75培养瓶15ml，T-150培养瓶30ml。
Q6：如何在细胞铺板时避免“边缘效应”？
A：细胞实验铺板时，为避免“边缘效应”，以应用96孔板的中间60孔为最佳，一般四周的一圈边缘孔不养细胞，只做空白或阴性对照。铺板时，细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来而导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练操作，尽快上板。
2
细胞的复苏与冻存(原则是慢冻速融)
细胞复苏：
指将冻存的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。
复苏过程如下图所示：
Q&A
Q1：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁?
A：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。
Q2：为什么细胞贴壁了，却长不起来?
A：此时需要考虑的是细胞密度问题，一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。
细胞冻存：
将细胞放在低温环境(-70℃~-196℃)，细胞内的代谢降低，可最大限度保存细胞活力，以便长期储存。
Q&A
Q1：目前细胞冻存液多采用什么配方?
A：目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。
Q2：细胞冻存时对细胞量有要求吗?
A：细胞复苏时会有一定的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，起始浓度106—107个/ml/管。
3
细胞的传代培养
细胞传代：
细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到抑制，影响细胞状态，因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。
Q&A
Q1：如何确定细胞对数期？
A：根据细胞生长曲线，为了确保活力，必须使细胞保持在对数期就传代，所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。
Q2：消化很关键吗?
A：不得不说，细胞状态差，很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同，因此对胰酶的反应也不同，我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止；而非细胞全部分散成单个。胰酶要注意不要反复冻融哦！
Q3：部分比较难消化的细胞怎么办?
A：可放于37℃培养箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受细胞为例，放于37℃培养箱消化5-8min，轻轻拍打，才见细胞成片移动，因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。
Q4：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理?
A：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。
Q5：如何避免细胞培养过程中的污染？
A：主要还是考虑无菌环境，尽量做好操作台的灭菌，别把培养基滴落在生物安全柜的入风口，别在培养箱里把培养基打翻。紫外无法杀灭霉菌，酒精也不行，只能用甲醛熏蒸，但是一定要注意安全。复苏的时候，水浴锅也需要进行灭菌处理。一旦出现污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情况下，选择扔掉，避免交叉感染，要不只能整个实验室消毒了。
Q6：细胞污染怎么办?
A：如发现细胞有污染，一般建议丢弃。如果细胞非常宝贵，可试着加入含抗生素的培养基反复清洗，并用抗生素含量高的培养基培养，并经常更换培养基。
养细胞是一件心肺的事情，要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她。细胞养不好，做实验就犹如无米之炊。希望我们的推送能给大家的实验操作带来一些帮助。相信经过不断的实践与摸索，你的细胞会更加漂亮！
PS：还有想要了解的实验技巧，可以在文末留言哦！
（本文图文整理自网络）
图文整理 | 孙思
南京大学医学院研究生会学术部
美编 | 陈钰兮
南京大学医学院研究生会宣传部
责编 | 翁雅婧、王宇辰
南京大学医学院研究生会
责编 | 陈笑夜
南京大学医学院团委
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