你还不知道癌症单细胞数据挖掘文章怎么写吗?

目前胰腺导管腺癌（PDAC）的病理和分子分类为治疗方案提供了有限的指导，尤其是免疫疗法。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是PDAC中脱髓鞘基质的主要参与者，调节着肿瘤的进展和治疗反应。利用单细胞RNA测序，探索了不同程度脱髓鞘的PDAC患者的肿瘤间异质性，发现在极度致密型和松散型PDAC（致密型，高脱髓鞘；松散型，低脱髓鞘）之间，CAFs、导管癌细胞和免疫细胞存在大量的肿瘤间异质性。值得注意的是，没有检测到CAF丰度的差异，但与致密型PDAC相比，在松散型PDAC中发现了一种具有高度活化代谢状态的新型CAFs（meCAFs）。MeCAFs具有高度活跃的糖酵解，而相应的癌细胞使用氧化磷酸化作为主要的代谢模式，而不是糖酵解。松散型PDAC中免疫细胞的比例和活性远远高于致密型PDAC。然后，在PDAC队列和一个公共数据库中进一步验证了CAF亚型的临床意义。具有丰富meCAFs的PDAC患者有较高的转移风险和较差的预后，但对免疫疗法的反应明显更好（64.71%的客观反应率，一个完全反应）。本文描述了致密型和松散型PDACs之间的细胞成分、免疫活性和代谢状态的肿瘤间异质性，并确定meCAFs是一种新的CAF亚型，对PDAC的进展和对免疫疗法的敏感性至关重要。

9个具有致密和疏松基质的人类PDAC样本，以及一个相邻的正常样本被分离成单细胞，然后使用10×基因组平台进行scRNA-seq。来自四个PDAC和两个正常组织的公共scRNA-seq数据被纳入比较和联合分析。

1、单细胞分析揭示了密集型和松散型人类 PDAC 之间的肿瘤间异质性

最近对人类PDAC的scRNA-seq研究揭示了PDAC肿瘤的瘤内异质性，这对详细剖析肿瘤相关机制是至关重要的。PDAC的标志是由CAFs引起的广泛脱髓鞘；然而，在临床实践中经常遇到具有不同组织学特征的PDAC肿瘤。一项队列研究报告说，脱髓鞘程度低的PDACs占所有PDAC肿瘤的20%左右。以前，致密型和疏松型PDACs根据组织学特征进行分类，但没有分子生物标志物来表明它们在预后和治疗选择方面的潜在差异。为了探索PDACs不同质地的肿瘤间异质性，首先根据肿瘤组织病理学（Haemotoxylin和Eosin；H&E和Masson染色）将PDACs分为密集型和疏松型。

9个来自未经治疗的PDAC患者的肿瘤，包括4个致密型PDAC、3个松散型PDAC和2个中等类型的PDAC（介于致密型和松散型PDAC之间）以及一个邻近的正常样本，被酶解成单细胞悬液，然后使用10×基因组平台进行单细胞测序（图2a, b）。为了提高分析能力，将所有10个样本的数据与公共数据（4个公共PDAC样本和2个正常胰腺样本）相结合。经过质量控制和去除低质量细胞后，共有77,121个细胞（38,831个细胞和来自公共数据的38,290个细胞）被保留用于下游分析。观察并校正了样品间的批次效应。基于图形的细胞聚类确定了20个亚群，每个亚群中都有统一的流形逼近和投影（UMAP）特征基因，与文献中已知的细胞簇标志物引用，并被用来注释不同的细胞类型（图2c）。八种主要的细胞类型被描述出来：导管、腺泡、内分泌、内皮、B细胞、T细胞、成纤维细胞和巨噬细胞（图2d）。令人惊讶的是，两种类型的PDACs之间CAFs的比例是相当的。然而，免疫细胞的比例，包括T细胞和巨噬细胞，在松散型PDACs中比密集型PDACs高得多（图2c）。然后用免疫荧光（IF）染色来确认致密型和松散型PDAC中不同细胞类型比例的变化。9个进行scRNA-Seq的PDAC样本被多重染色。结果显示，松散的基质与浸润的T细胞和巨噬细胞的增加有关（图2e）。因此，这些结果表明密集型和疏松型的人类PDAC中基质细胞成分的异质性。

思路注解：根据不同的分型进行定义样本的大类，分别对致密型和松散型PDAC进行单细胞分析，对细胞类型占比统计得出两种类型的细胞含量的差异。

2、在松散型 PDAC 中识别出 meCAF

为了确定PDAC中CAF亚群的特征，进行了无监督聚类分析，结果显示，CAFs被分为星状细胞和成纤维细胞样CAFs，根据其标记基因可以进一步分为六个亚群。星状细胞型CAFs被分为两个亚群，C1（通过标记基因RGS5和CD36）和C2（通过标记基因MT1M和TAGLN），而成纤维细胞型CAFs被分为四个亚群（C0、C3、C4和C5）（图3a，b）。根据以前的研究，表明亚群C3是myCAFs，它高度表达COL10A1和POSTN，其标记基因与ECM-受体相互作用和PI3K/AKT信号传导有关（图3a，c）。C0亚群与iCAFs相似，因为C0中的标记基因参与了炎症途径，如补体级联、细胞因子介导的信号传导和细胞趋化途径（图3c）。C5亚群没有典型的标记基因，而CD74和HLA-DRA的表达略有增加，表明其潜在的抗原呈递功能较弱。最有趣的是，发现了一个新的亚群C4，其特点是PLA2G2A和CRABP2的高表达，其标记基因与翻译、线粒体翻译延伸和糖酵解有关，因此C4被命名为meCAFs（图3a，c）。为了进一步确认PDAC中meCAF、myCAF和iCAF的存在，用这三种CAF亚群的标记物（APOD代表C0 iCAF，橙色；POSTN代表C3 myCAF，红色；PLA2G2A代表C4 meCAF，绿色）对九个PDAC样本进行了scRNA-seq的多重IF染色。如图3d所示，在PDAC样本上观察到很少的重叠信号，表明PDAC的肿瘤微环境（TME）中有三种不同的CAF亚群（图3d）。胰腺星状细胞（PSCs）被认为是PDAC中CAFs的主要前体43。与以前的研究结果一致，CAFs的伪时间分析显示，星状细胞（C1和C2）是C0、C3、C4和C5的共同前体，而C0和C4是终末分化的细胞群。以前的研究表明，具有高可塑性的CAFs有可能从一种状态过渡到另一种状态。在此表明，C3有可能转化为C0或C4，这需要进一步研究。

思路注解：本质是对成纤维细胞的再聚类分型，根据marker基因进行细胞的细化分，需要很深厚的生物功底。最后根据拟时序研究不同类型细胞的分化。

3、肿瘤细胞和CAFs之间的串扰决定了致密型和松散型PDAC的不同微环境

CAF的异质性是由来自不同肿瘤细胞的信号在空间上调节的。以前的研究发现，肿瘤细胞内的TGFβ和IL-1/JAK/STAT3信号传导是负责myCAF和iCAF形成的主要途径。为了阐明myCAFs的形成，揭示了密集型和松散型PDACs之间的导管癌细胞的瘤间异质性。根据之前通过批量RNA-seq定义的经典型和基底型PDACs，两项独立的scRNA-seq研究显示，他们数据中的大多数PDACs都拥有经典型基因特征。在Elyada的scRNA-seq分析中，人类PDAC中的导管癌细胞被聚集在两个主要的亚型：经典型（通过TFF1、TFF2、LYZ、VSIG2和CEACAM6标记基因）和分泌型（通过SPP1、CLU、CTGF和COL18A1标记基因）亚型。在本研究中，导管癌细胞被聚类为四个主要群体（C2、C6、C10、C19）（图4a）。通过比较两种类型的PDAC肿瘤，发现C6亚群在密集型PDACs中占优势，而C2亚群在松散型PDACs中占优势（图4b）。值得注意的是，C2亚群表达经典基因，如TFF1、LYZ、TMASF1和LAMB3，而C6亚群表达基因，如DMNK、LDHB、HPGD和MYLC。标志基因的GO和KEGG分析表明，导管癌细胞C6亚群中高表达的基因涉及糖酵解、氨基酸的生物合成、HIF-1α信号传导、ECM结合和上皮细胞分化。相反，C2亚群被证明表达富含氧化磷酸化、ECM分解、I型干扰素信号、抗原呈现和白细胞跨内皮迁移的基因（图4c，d）。这些数据揭示了C2和C6亚群的独特代谢特征，这可能与它们在肿瘤中的不同位置和周围的TME有关。此外，C2亚群中ECM分解相关基因的高表达可能是松散型PDAC中脱髓鞘程度较低的原因。相反，C6亚群中与ECM-细胞相互作用有关的基因表达升高，可能对致密型PDAC细胞的生存至关重要。此外，还发现C2亚群中表达的基因具有炎症特征，包括那些参与促进免疫细胞贩运和抗原呈现以及激活干扰素信号的基因。这一结果与我们发现的松散型PDAC中T细胞和巨噬细胞群的比例明显增加是一致的。

思路注解：比较致密型和松散型CAFs中亚型的情况，C6亚群在密集型PDACs中占优势，C2亚群在松散型PDACs中占优势，最后对2种亚型的marker基因进行富集分析 ，此外图4e和4f分析了两种分型与免疫细胞的关系，密集型和松散型在PDAC中T细胞亚群的比例（4个密集型病例，3个松散型病例），以UMAP图表示。CD8+T细胞组在所有T细胞中的比例在松散型PDAC中明显增加。y轴代表每个T细胞亚群在所有T细胞中的比例，x轴代表不同的T细胞亚群。红柱和绿柱分别代表密集型PDAC和松散型PDAC。数据以平均值±SEM表示。所有的统计分析均采用双侧的Mann-Whitney U检验。*P < 0.05.。

4、具有 meCAFs 的松散型 PDACs 显示出明显的预后

由于我们在上面定义的致密型和松散型PDACs的肿瘤间异质性，假设这种差异可能影响患者的预后和对治疗的反应。致密型PDAC具有适应TME的能力，而TME的特点是缺氧和血液供应不足，因此，该分型可能对化疗的敏感性低于其他类型。富含基质的TME降低了转移和侵袭能力，减少了免疫细胞对肿瘤细胞的接触；因此，这种类型可以被认为是一种相对 "免疫不敏感 "的肿瘤。相反，由于基质限制较少，松散型PDACs具有相对较高的入侵和转移能力，并且比密集型PDACs具有更多的浸润性免疫细胞；因此，这种类型被认为是一种 "免疫敏感"肿瘤。

为了验证这个假设，首先跟踪了7名患者（3名松散型PDACs患者和4名致密型PDACs患者），他们被招募到scRNA-seq研究中。与假设一致，所有3名松散型PDAC患者在手术后6个月内复发了。此外，使用TCGA数据库分析了多个CAF亚群中的标记基因与患者预后的关系。发现，meCAFs的联合标记基因与患者的生存期呈负相关（图5a）。此外，为了验证上述六个CAF亚群的标记基因的表达，在PDAC组织阵列上对每个亚群的标记基因（PLA2G2A和CRABP2代表C4 meCAFs，POSTN代表C3 myCAFs，APOD代表C0 iCAFs，RGS5代表C1，MYH11代表C2）进行免疫组织化学染色（Renji队列，n = 94）。观察到，PLA2G2A和CRABP2阳性的成纤维细胞主要存在于具有松散基质的PDAC中（P < 0.001）。相反，POSTN阳性成纤维细胞在致密基质中大量存在（P = 0.012）。预后分析结果显示，基质中meCAF标志物（PLA2G2A + CRABP2）的高表达与总生存率低有关（HR：3.900，95%CI：2.134-7.127）（图5b）。与临床病理特征的相关性分析显示，meCAFs与患者的血管侵袭呈正相关。然而，其他四个CAF亚组没有发现与总生存期相关（图5c-f）。这些数据进一步表明，meCAFs可能与PDAC的高转移潜力有关，从而影响患者的预后。

思路注解：根据单细胞分出的CAF亚群，对TCGA数据进行分析。例如meCAF这种亚型的marker基因在TCGA数据库进行分数的构建，随后分型。

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