怎么培养高纯度、功能性强的细胞
发布于 2022-06-04 06:23
细胞培养是生命科学研究中最基础，也是最常用的实验手段。科研培养细胞等目标都是为了把细胞养成形态漂亮、增值倍数高、纯度高、功能性强的样子。
为了实现这个目标，不少人洒了很多热血，还有那一去不复返的经费。可事与愿违，细胞一向难伺候，要将其真正养好，也十分不易。那今天就来聊一聊培养细胞的这些事。
1、无菌室
无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。此外，还应注意防止无菌室的污染。
2、超净工作台
超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。
当然，细胞培养还需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。
细胞培养的一大优势在于能控制细胞生长的物理化学环境，即温度、PH值、渗透压、CO2等。除温度外，培养环境均有细胞培养基控制。
细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。
培养基中常常添加血清、抗生素等成分。培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。由于细胞种类和培养条件不同，细胞培养基的选择也不同，在动物细胞培养中最常用的培养基是合成细胞培养基，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。
正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。
细胞培养基质量应符合下表所示的技术要求。
目前主要有2种基本的细胞培养体系，一是使细胞在人工基质上单层生长 (贴壁培养)，二是是使细胞在培养基中自由漂浮生长 (悬浮培养)。
除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞粘附和伸展组织培养处理。
但是，许多细胞系也可采用悬浮培养，悬浮培养细胞可在未经组织培养处理的培养瓶中培养，但是培养容量表面积比(通常为0.2–0.5 ml/cm2)的增加，阻碍了有效的气体交换，因此需要对培养基进行搅动。这种搅动一般通过磁力搅拌器或者转瓶实现。
注：除了贴壁细胞和悬浮细胞之外，还有一种半悬浮/半贴壁的细胞。
应对细胞污染的最好对策是预防！这也是在实验中强调无菌操作和灭菌的原因之一。细胞污染后最好的处理方式是丢弃，不到不得已不建议施救。
常见的细胞污染分为以下几类：
1、细菌污染
•培养物通常呈云雾状（即浑浊状），有时表面会覆盖一层薄膜
•pH 突然降低•高倍镜下可分辨出细菌的形状
2、霉菌污染
•培养物浑浊
•污染初期 pH 值稳定，严重后 pH 值迅速升高
•显微镜下通常呈细束状纤维，或较为密集的孢子团块
3、酵母污染
•培养基变浑浊，尤其是污染后
•一般 pH 值变化很小，严重时 pH 值升高
•显微镜下呈卵圆形或球形颗粒，有些会芽生较小颗粒
4、支原体污染
•体积较小（一般＜1um），导致难以发现
•细胞增殖速度降低，饱和密度下降，悬浮培养物聚集
•定期检测培养物（支原体检测试剂盒）
5、病毒污染
•体积极小，检测及去除十分困难
•常常因为观察到细胞生长和形态发生改变而发现
•会对实验室工作人员造成严重的健康威胁
•使用质量好的血清产品降低病毒污染的风险
6、非同种细胞污染
•由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染
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