【文献解读】A20两种不同的泛素结合基元介导了其抗炎和细胞保护活性

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Martens A ，  Priem D ，  Hoste E ， et al. Two distinct ubiquitin-binding motifs in A20 mediate its anti-inflammatory and cell-protective activities[J]. Nature Immunology， 2020， 21(4):1-7.

Two distinct ubiquitin-binding motifs in A20 mediate its anti-inflammatory and cell-protective activities

A20两种不同的泛素结合基元介导了其抗炎和细胞保护活性

摘要

    蛋白质泛素化调控蛋白质的稳定性和信号复合物的组成。A20是炎症信号转导的负调控因子，但其分子机制尚不清楚。在这里，我们采用Tnfaip3基因靶向的A20突变小鼠，而ZnF7和ZnF4泛素结合区域具有失活突变性，揭示了泛素结合在A20抑制炎症疾病中至关重要。我们证明，一个功能性的ZnF7结构域需要将A20吸引到肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)信号复合物中，并抑制炎症信号和细胞死亡。ZnF4和ZnF7联合灭活可引起A20缺陷小鼠的出生后致死率升高和严重的多器官炎症。突变体A20的条件组织特异性表达进一步揭示了泛素结合在髓系和肠上皮细胞中的关键作用。总的来说，这些结果表明A20的抗炎和细胞保护功能在很大程度上依赖于其与泛素结合的特性。

摘要

A20也被称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)，与多种炎症性疾病有关，并被证明通过抑制炎性NF-κB信号传导和促进细胞存活发挥作用。A20被认为是修饰泛素的酶，这种酶可以抑制NF-κB信号，通过调制的泛素化状态特定部分蛋白质联合的去泛素化酶和E3泛素连接酶的活性，在激活TNFR13之后促进K48连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解的目标。在A20的DUB（泛素分解酶）或E3连接酶失活突变的转基因小鼠株大体正常，不会发生神经炎症性疾病，与A20缺陷小鼠中看到的全身炎症和围产期死亡率形成鲜明对比。

为了确定A20的ZnF7结构域在体内的生理作用，我们生成了靶向Tnfaip3基因的A20突变小鼠，在ZnF7基元C764A和C767A(以下简称A20ZnF7; 扩展数据图1a)，这在之前被证明可以消除A20与线性多聚泛素链结合的能力。纯合子A20ZnF7/ ZnF7敲入小鼠，来自杂交A20ZnF7/+小鼠，其出生具有预期的孟德尔频率，且未显示围产期死亡率(扩展数据图1b)。这一表型与Tnfaip3 - / -小鼠对比，在我们的小鼠中，Tnfaip3 - / -小鼠发展为围绝经期毒性恶病质，并在断奶年龄前死亡(数据未显示)。然而，所有A20ZnF7/ZnF7敲入小鼠的体重都严重下降(图1a和扩展数据图1c)，且只有很少数量产生后代。年轻A20ZnF7/ZnF7的宏观和组织学检查显示脾肿大，淋巴结病(扩展数据图1 d)，爪肿胀与没有指甲(扩展数据图1 e)、骨侵蚀(扩展数据图1 f)和联合炎症(扩展数据图1 g)，如前所示，也在其他组织炎症和免疫细胞浸润，如肝细胞(图1 b)。对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的染色显示，在A20ZnF7/ZnF7肝脏中存在大量凋亡细胞，而在对照肝脏中没有(图1c，d)，表明A20ZnF7的表达使肝细胞凋亡。与观察到的表型一致，A20ZnF7/ZnF7敲入小鼠血清中有高浓度的炎症因子TNF和白细胞介素-6 (IL-6，图1e)。流仪分析脾脏组织显示A20ZnF7 / ZnF7敲入小鼠骨髓细胞的数量增加但B细胞数目减少，T细胞和自然杀伤(NK)细胞，证明ZnF7域表达A20调节免疫内稳态(图1 f和扩展数据图2)。最后，A20ZnF7/ZnF7髓系细胞显示细胞内TNF含量增加(图1g)，与血清中检测到的TNF浓度增加一致。 

图1：A20^ZnF7/ZnF7敲入小鼠发生自发炎症病理，并对TNF诱导的毒性敏感

(a) A20^ZnF7/+和A20^ZnF7/ZnF7小鼠体重与时间的关系。每个点代表一只生物学上独立的小鼠9周龄小鼠:A20^ZnF7/+，n=16；A20^ZnF7/ZnF7，n=6；12周龄小鼠:A20^ZnF7/+，n=15；A20^ZnF7/ZnF7，n=7；15周龄小鼠:A20^ZnF7/+，n=11；A20^ZnF7/ZnF7，n=7)。数据用平均值±s.e.m.表示。****P＜0.0001(指定基因型之间的参数双向方差分析)。

(b) 28周龄对照组A20^+/+和A20^ZnF7/ZnF7的代表性苏木精和伊红染色肝脏切片。比例尺：200µm和50µm。每组至少有5只生物学上独立的小鼠具有代表性。

(c、d) A20^ZnF7/ZnF7小鼠和对照组A20^+/+肝脏切片上的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3切割免疫组化

(c) 以及每平方毫米半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞的数量(A20^ZnF7/ZnF7，n=5个生物学独立样品；A20^+/+，n=4个生物学独立样品

(d) 所示图片代表了每组5只生物学上独立的小鼠。比例尺20μm(插图，10μm)。数据用平均值±s.e.m.表示。*P=0.0159(指示基因型之间的双侧非参数Mann-Whitneyu检验)。

(e) 15~30周龄A20^+/+、A20^ZnF7/+和A20^ZnF7/ZnF7对照组小鼠血清中IL-6和TNF的水平。每个点代表一个生物学上独立的小鼠(IL-6:A20^+/+，n=16；A20^ZnF7/+n=14；A20^ZnF7/ZnF7，n=25；TNF:A20^+/+，n=11；A20^ZnF7/+，n=4。A20^ZnF7/ZnF7，n=20)。数据用平均值±s.e.m.表示。*P=0.0133；**P=0.0014；****P＜0.0001(指定基因型之间的参数单因素方差分析)。

(f) 流式细胞术测定A20^+/+、A20^ZnF7/+、A20^ZnF7/ZnF7小鼠脾脏指示免疫细胞群的绝对细胞数。每个点代表一只生物学上独立的小鼠(A20^+/+，n=6；A20^ZnF7/+n=6；A20^ZnF7/ZnF7，n=8)。数据用平均值±s.e.m.表示。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001(指示基因型之间的双侧非参数Mann-Whitneyu检验)。

(g) A20^+/+，A20^ZnF7/+和A20^ZnF7/ZnF7小鼠分离的脾细胞在蛋白运输抑制剂存在下孵育4h，通过流式细胞术检测细胞内TNF的生成。柱状图表示巨噬细胞总数(上)和Ly6Chi单核细胞(下)中TNF产生的百分比。每个点代表一只生物学上独立的小鼠(A20^+/+，n=5；A20^ZnF7/+n=4；A20^ZnF7/ZnF7，n=5)。数据用平均值±s.e.m.表示。*P＜0.05；0.01(指示基因型之间的双侧非参数Mann-WhitneyU-test)。

(h) 注射重组mTNF(i.p，5μg/20g体重)的A20^ZnF7/ZnF7小鼠和对照组幼崽的体温和存活率随时间的变化(A20^+/+，n=7；A20^ZnF7/+n=5；A20^ZnF7/ZnF7，n=5只小鼠)。数据用平均值±s.e.m.表示。**P＜0.01；***P＜0.001(体温、REML分析和生存率，双侧Mantel-Cox试验)。

(i) 在注射重组mTNF3小时后，对对照组A20^+/+和A20^ZnF7/ZnF7小鼠的小肠(SI)和肝脏切片进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3染色。比例尺，200µm(肝)和100µm(小肠)。所示的图片代表了每组5只生物学上独立的小鼠。

图2：^ZnF7对于a20介导的炎症信号抑制和细胞死亡至关重要。

(a) 用TNF刺激A20^+/+、A20^ZnF7/ZnF7和A20^−/−MEF细胞的全细胞裂解液的免疫印迹分析。肌动蛋白显示为负载控制。图代表三个独立实验。

(b) 对照组A20^+/+，A20^ZnF7/ZnF7和A20^−/−MEF细胞的IL-6分泌，TNF刺激或未刺激(n.s)4h(A20^+/+，n=3；A20^ZnF7/ZnF7，n=3；A20^−/−，n=3个独立细胞培养)。****P＜0.0001(指定基因型之间的参数双向方差分析)。数据用平均值±s.e.m.表示。

(c) 免疫印迹分析A20^+/+，A20^ZnF7/ZnF7和A20^myel-KO巨噬细胞经LPS刺激后的全细胞裂解物，如下图所示。β-微管蛋白作为负载控制。图代表三个独立实验。

(d) 从对照组A20^+/+(n=5)，A20^ZnF7/ZnF7(n=5)和A20^myel-KO(n=5)小鼠分离的巨噬细胞中，LPS刺激或不刺激6h，TNF和IL-6的分泌。***P＜0.001；****P＜0.0001(指定基因型之间的参数双向方差分析)。数据用平均值±s.e.m.表示。

(e) 从A20^+/+，A20^myel-KO和A20^ZnF7/ZnF7小鼠中分离的巨噬细胞经Flag-TNF(1µg/ml−1)刺激后的指定时间内进行TNFR1拉下试验，并在USP2存在下(24µg/ml−1)对TNFR1复合物进行免疫沉淀(IP)，并对A20进行免疫印迹。肌动蛋白显示为负载控制。图代表三个独立实验。

(f) 从A20^+/+，A20^myel-KO和A20^ZnF7/ZnF7小鼠中分离的巨噬细胞被Flag-TNF(1µg/ml−1)刺激后，在指定的时间段内，TNFR1对巨噬细胞的抑制作用，使用anti-Flag珠免疫沉淀TNFR1复合物，并免疫印迹A20，RIPK1，TRADD和M1。图代表三个独立实验。

(g) 小鼠TNF(mTNF)刺激A20^+/+、A20^ZnF7/ZnF7和A20^−/−纤维细胞死亡诱导的时间函数，通过SytoxGreen(SG+)阳性测量。数据用平均值±s.e.m.表示。，且在三个独立实验中具有代表性(A20^+/+，n=3；A20^ZnF7/ZnF7，n=3；A20^myel-KO，n=3个独立细胞培养)。**P＜0.01(RELM分析)。

(h) 免疫印迹分析A20，全长(Fl)和cleaved(Cl)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在小鼠TNF刺激的A20^+/+，A20^ZnF7/ZnF7和A20^−/−mef中的表达。肌动蛋白显示为负载控制。图代表三个独立实验。

(i) 免疫印迹法检测A20^+/+、A20^ZnF7/ZnF7和A20^myel-KO在LPS和/或ATP刺激或未刺激的巨噬细胞中半膀氨酸天冬氨酸蛋白酶1蛋白和半膀氨酸天冬氨酸蛋白酶1(p20)切片。三个独立实验的数据具有代表性。

(j) 从A20^+/+(n=5)，A20^ZnF7/ZnF7(n=5)和A20^myel-KO(n=5)小鼠(LPS和ATP刺激或不刺激)分离的巨噬细胞中IL-1β和IL-18的分泌。数据代表平均值±s.e.m.。**P＜0.01；****P＜0.0001(指定基因型之间的参数双向方差分析)。

(k) 在LPS和ATP刺激下A20^+/+(n=5)，A20^ZnF7/ZnF7(n=5)和A20^myel-KO(n=5)小鼠的巨噬细胞中诱导死亡，通过SG摄取测量。数据以平均值±s.e.m.表示。具有三个独立实验的代表性。***P＜0.001(RELM分析)。

图3：A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}敲入小鼠表型拷贝A20敲除小鼠。

(a) 2周龄对照A20^+/+和A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}小鼠肝脏大体外观。注意A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}肝脏中苍白的无细胞区。图片代表了三只生物学上独立的小鼠。

(b) 2周龄对照A20^+/+和A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}肠道(SI和结肠)、肝脏和皮肤的代表性苏木精和伊红染色切片。注意所有A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}组织切片均有严重炎症。比例尺，100μm。图片代表了三只生物学上独立的小鼠。

(c) 2周龄对照A20^+/+和A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}小鼠肝脏切片上半膀氨酸天冬氨酸蛋白酶3切片的免疫染色。图片代表了三只生物学上独立的小鼠。比例尺，50µm(插图，20µm)。

(d) 2周龄对照A20^+/+和A20^{ZnF4ZnF7/ZnF7}小鼠肝脏切片中切割的半膀氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞的定量分析。每mm2中被切割的半膀氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数(A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}，n=5；A20^+/+，n=3只小鼠)。数据用平均值±s.e.m.表示。每个点代表一个单独的鼠标。*P=0.036(指示基因型之间的双侧非参数Mann-Whitneyu检验)。

(e) 对照组A20^+/+、A20^ZnF4ZnF7/+和A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}小鼠2周龄血清中IL-6和TNF的水平。每个点代表一只生物学上独立的小鼠(A20^+/+，n=19；A20^ZnF4ZnF7/+n=21；A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}，n=11)。数据用平均值±s.e.m.表示。****P＜0.0001(指定基因型之间的参数单因素方差分析)。

(f) 代表性苏木精和伊红染色的肝脏和肝脏切片2周龄A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}MyD88^−/−小鼠和A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}MyD88+/−同种属的皮肤组织。比例尺，100μm。图片代表了

三只生物学上独立的小鼠。

(g) 15周龄A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}MyD88^−/−小鼠体重与对照组比较。数据表示为均值±s.e.m。每个点代表一个生物学上独立的小鼠(A20^ZnF4ZnF7/+MyD88^+/+，n=5；A20^+/+MyD88^−/−，n=11；A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}MyD88^−/−，n=5)。****P＜0.0001(指定基因型之间的参数单因素方差分析)。

(h) 15周龄A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}MyD88^−/−小鼠与对照野生型小鼠后爪的代表性图片。

(i) 15周龄A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}MyD88^−/−小鼠和对照野生型小鼠的代表性苏木精和伊红染色肝脏切片(标尺：50μm)。图片代表了三只生物学上独立的小鼠。

注意:在图3-i中，A20^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}不能作为对照小鼠，因为这些小鼠无法存活超过3周龄。

图4：组织特异性A20^ZnF4ZnF7表达表型拷贝组织特异性A20缺失。

(a) 2周龄对照组(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}CreDel^+/+) Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}CreDel^Tg/+同种属小鼠肝脏大体外观。注意Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}CreDel^Tg/+肝脏中苍白色的脱细胞区。

(b) 32周龄对照(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^+/+)和Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+同种属小鼠后爪的代表性图片。

(c) 对照组(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^+/+)和Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+littermate小鼠(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCreTg^+/+，n=6-15只小鼠/每个年龄，Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+，n=12-25只小鼠/每个年龄)的两周临床关节炎评分。数据以平均值s.e.m.表示。**P=0.002(REML分析)。

(d) 苏木精和伊红染色小鼠踝关节的组织学图像。图片代表了5只生物学上独立的小鼠。

(e) 具有指定基因型的小鼠炎症、骨侵蚀和软骨破坏的组织学评分图表(28-33周)。图中的圆点表示单个小鼠(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^+/+，n=10；Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+，n=21)。数据表示为平均值s.e.m.*P=0.0141；***P=0.0003；****P＜0.0001(指示基因型之间的双侧非参数MannWhitneyu检验)。

(f) 30~40周龄对照组(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^+/+)和Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+小鼠血清中IL-6和TNF水平。每个点代表一只生物学上独立的小鼠(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^+/+，n=11 Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+，n=27)。数据用均数s.e.m.表示**P=0.0017；****P＜0.0001(指示基因型之间的双侧非参数MannWhitneyu检验)。

(g) 从对照组(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^+/+，n=6)、Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}LysMCre^Tg/+(n=6)和A20^myel-KO(n=6)同种属小鼠LPS刺激指示时间点分离的巨噬细胞分泌TNF和IL-6。数据表示为平均值s.e.m.**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001(各时间点指示基因型之间的参数双向方差分析)。

(h、i) Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}villinc^Tg/+(n=5)和对照组(Tnfaip3^{ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7}villinCre^+/+，n=6)鼠每20g体重注射5μg重组小鼠TNF。体温(h图中平均s.e.m.，***P＜0.001，REML分析)和生存期(i图中**P=0.0018，双侧MantelCox检验)作为时间的函数。

(j) 注射TNF后5小时，标记基因型的小鼠小肠切片上具有代表性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3特异性剪切染色。比例尺：100μm。

结果

    为了研究A20ZnF4ZnF7突变体在肠上皮细胞中表达的后果，我们通过将通用侧链的Tnfaip3ZnF4ZnF7小鼠与villin-Cre小鼠(Tnfaip3ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7Vil1-Cre)杂交，生成肠上皮细胞特异性的Tnfaip3ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7小鼠，并用正常非致死剂量的TNF刺激这些动物。和预期的一样，对照组的同窝动物都存活了下来，只是体温略有下降。相反，正如前面在肠上皮细胞特异性A20缺陷小鼠中所证明的，肠上皮细胞特异性Tnfaip3ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7小鼠表现出与TNF毒性相关的典型症状，包括体温过低和严重腹泻，最后，在右旋糖酐钠(DSS)诱导的结肠炎模型中，对肠上皮细胞特异性的Tnfaip3ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7小鼠和对照组同鼠进行评估。小鼠饮用1.5%DSS五天，每日监测临床病理。与对照组小鼠相比，肠上皮细胞-Tnfaip3ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7小鼠对DSS诱导的结肠炎的敏感性增加，这与肠上皮细胞特异性A20缺陷小鼠的表现相似(扩展数据图6d)。与对照组相比，肠上皮细胞-Tnfaip3ZnF4ZnF7/ZnF4ZnF7小鼠在DSS5d后表现出更明显的肠道屏障完整性丧失(扩展数据图6e)。然而，未受刺激的小鼠没有表现出自发的屏障通透性(扩展数据图6e)。总之，我们已经证明A20主要通过其ZnF4和ZnF7结构域作为泛素结合蛋白抑制促炎信号。当TNFR1和TLR4被激活时，A20通过其ZnF7与线性泛素链结合，被吸收到受体复合物中，以稳定各自的信号复合物并抑制下游的炎症信号。我们进一步表明，A20的抗炎活性也依赖于其K63泛素结合的ZnF4结构域，而同时缺乏ZnF4和ZnF7功能域的小鼠表型为A20缺陷小鼠，这些小鼠因严重的多器官炎症而死于围产期。总之，我们的观察表明，A20在抑制炎症中主要是非酶的作用，通过允许其吸收和稳定受体复合物中的泛素链。但是，A20的DUB功能在信号转导的下游调控中可能仍然很重要。然而，需要更多的研究来进一步研究这一点。过去十年的多项遗传学研究表明，TNFAIP3多态性与多种人类炎症和自身免疫性疾病有关。这些疾病相关变异大多位于TNFAIP3基因的上游或下游非编码区或内含子区，可能通过干扰细胞激活特异性增强因子的功能而影响A20的表达。此外，TNFAIP3的功能突变和缺失已经被确认，特别是在B细胞淋巴瘤患者中。这些TNFAIP3突变中的大多数与变码和过早终止密码子突变有关，这些突变阻止了ZnF7羧基端域的合成或破坏了其泛素结合能力。此外，A20不足最近被证明会导致严重的早发型自身炎症性疾病，从这些患者中分离出来的外周血单核细胞显示A20表达严重减少。我们的研究结果表明，这些突变可能导致多聚泛素结合缺陷，在这些患者中，这可能足以影响NF-κB信号传导和细胞死亡的稳态调节。

编辑：邢皓博  李柠岑

审核：陈波