转染效率不高?你的质粒纯度够高吗?

CiPP纯化策略

层析纯化领域最为经典就是由Cytiva（原GE生命科学）提出的CiPP（Capture, intermediate Purification, Polishing）纯化策略。该理论认为生物大分子的纯化需要在分辨率（Resolution）、速度（Speed）、载量（Capacity）和回收率（Recovery）之间取得平衡。

为了达到这种平衡，想要一步纯化达到目的几乎是无法完成的目标。而将基于不同原理的纯化技术结合在一起，才可能在保证高纯度的基础上，尽可能去追求更高的效率， CiPP纯化策略主要包含3个步骤（图1）：

1.Capture（捕获）

• 分离、浓缩和稳定目标产物，最好同时将主要的杂质去除。

2.Intermediate Purification（中间纯化）

• 将大量杂质去除。

3. Polishing（精纯）

• 最为困难的纯化步骤，用以去除难以去除的杂质残余，获得高纯度产物。

图1. CiPP纯化策略的三个步骤

经典的质粒纯化三步法

CiPP理论同时也适用于质粒的纯化，想要得到高纯度质粒，同样需要3个步骤（图2）：

图2. 质粒纯化步骤

1.捕获质粒DNA，去除RNA杂质

• 使用Sepharose™6 Fast Flow进行第一步纯化，它可根据分子大小的不同，对不同的组群进行分离，即分子筛原理。

• 质粒DNA和RNA的分子量差异很大，因此上样量可以达到0.3CV。

• 在纯化时，可同步进行缓冲液置换，直接与第二步亲和层析纯化进行无缝对接。

2.去除开环质粒DNA

• 使用Capto PlasmidSelect进行第二步纯化，它可以特异性将开环的质粒DNA (ocDNA)和超螺旋的质粒DNA (scDNA)分开。与传统的PlasmidSelect Xtra相比，Capto PlasmidSelect可以在更高的流速条件下获得更高的载量，其DBC可以达到3 mg/ml，经过二步纯化后，超螺旋质粒DNA的纯度可以提高到95%以上。

3.去除痕量杂质及内毒素

• 经过前两步层析纯化之后，质粒的纯度和均一性已经满足了生产需求，但依然存在内毒素的隐患，最后一步层析的重点即是去除内毒素和痕量杂质。使用高分辨率阴离子SOURCE30Q进行精纯后，内毒素含量可降至<1 EU/mg。

实验结果

图3展示了使用PlasmidSelect Xtra Starter Kit（Cytiva）在ÄKTAexplorer 100运行的数据，该Kit按照经典质粒纯化三步法配备了3种预装柱，可直接用于质粒纯化。

图3. 使用 PlasmidSelect Xtra Starter Kit 从澄清的碱性裂解液中纯化超螺旋质粒 DNA。oc = 开环；sc = 超螺旋。

各纯化组分进行电泳分析后发现（图4）：CiPP纯化策略出色的分离了超螺旋质粒DNA（sc）和开环DNA（oc）。

图4. 纯化组分进行电泳分析结果。

工艺的稳健可放大是商业化生产的重要考量点

在商业化生产中，随着上游培养规模的扩大，下游的纯化工艺也需要同步扩大。如何将小试阶段测试的纯化条件同步转移、扩大，并且保证工艺的稳健性和可重复性，这是生物制药工艺中面临的主要挑战。

为了达到这一目标，在纯化步骤中一般遵循线性放大原则，所谓线性放大，是指从实验室规模到中试结果或者工业生产级别，得到几乎一致的层析效果，如图5所示，经过400倍的放大后，纯化效果是完全可重复的。

如上所述，前面是基于PlasmidSelectXtra Starter Kit进行的实验室级别的条件摸索，能否顺利转移到工业级别，还需要考虑诸多因素：如体积流速、样品体积、柱床高度、线性流速、样品浓度等等。

而一个成熟的工艺必须在前期就充分考虑到后期的可放大性和稳健性，在此，Cytiva也测试了30倍放大生产规模，用以满足质粒生产的中试需求。

层析结果如图6所示，通过与实验室级别的图3比较，可以发现：两者之间图形模式完全一致，表明层析结果得到了很好的线性放大。

图6. 在 ÄKTApilot 系统上进行30倍放大后的纯化效果，与图4的层析结果一致，实现了线性放大。oc = 开环；sc = 超螺旋。

对纯化组分的关键参数分析后发现（表1）：经过30倍放大后，最终纯化产物中：超螺旋质粒DNA纯度为98%，内毒素含量低于0.1 EU/mg，回收率为69%。

表1. 纯化组分分析结果