【文献解读】Plant Sci.:紫外照射下葡萄果实发育过程中黄烷-3-醇的生物合成

发布于 2021-10-07 19:09

文献解读 324

紫外照射下葡萄果实发育过程中黄烷-3-醇的生物合成

期刊：Plant Science （4.729）

发表时间：2013.07

研究背景

紫外线被认为是影响植物发育和生理的主要环境因素之一。大量研究表明紫外可以诱导类黄酮积累和其他保护性机制。按照波长，紫外线分为三种类型:UV-A(315–390纳米)、UV-B(280–315纳米)和UV-C (≤280纳米)。几乎所有的UV-A和大部分的UV-B都能通过臭氧层,从而影响植物的发育和生理。但是UV-C 几乎完全被臭氧层吸收。也有研究证明，光照和不同类型的紫外线照射可以增加黄酮类化合物的含量，并影响植物体内黄酮类化合物的组成。

黄烷-3-醇在数量上是葡萄浆果中最丰富的黄酮类化合物，它们的低聚物和聚合物通常被称为缩合单宁或原花色素(PAC)。它们是在酿酒过程中，具有调整葡萄酒中的苦味、涩味和颜色稳定性等重要作用。黄烷-3- 醇和花青素的合成在类黄酮途径的上游有共同的步骤。而花青素还原酶(ANR)和原花青素还原酶(LAR)对合成黄烷-3-醇具有特异性。LAR有两个高度相关的同基因。LAR1的表达几乎局限于葡萄浆果的种子，而 LAR2在果皮和种子中都有表达。

目前已经确定了四种调节葡萄中黄烷-3-醇生物合成的转录因子:VvMYB5a、VvMYB5b、VvMYBPA1和VvMYBPA2。它们都属于R2R3-MYB 家族，诱导一般类黄酮途径，特别是PAC生物合成途径的结构基因的表达。已经发现VvMYB5b、VvMYBPA1和VvMYBPA2激活VvANS、VvANR和VvLAR1的表达，而VvMYB5a似乎只调节VvANS和 VvLAR1的表达。VvMYBPA1和VvMYBPA2都不能诱导VvLAR2的表达。此外，没有证据表明VvMYB5a和VvMYB5b可以增强VvLAR2的表达。

紫外线对类黄酮代谢调节的研究以前相比较于黄烷-3醇，更多集中在花青素上。已经有研究在拟南芥、玉米、水稻、苹果、葡萄、胡萝卜、茄子、玫瑰、莴苣和辣椒的果实中观察到紫外线对花青素积累的刺激。且已有报道揭示紫外调节花青素含量影响其相关基因及转录因子。

本工作通过PCR研究了三种紫外线照射对葡萄果实中编码黄烷-3-醇合成关键酶的不同基因及其调控基因转录水平的影响。各种黄烷-3-醇的含量也通过高效液相色谱-质谱检测技术进行评估。考虑了与合成黄烷-3-醇相关的三个主要发育阶段：后3周(黄烷-3-醇的积累)、7周(黄烷-3-醇合成的结束)和11周(仅合成花青素，但不合成黄烷-3-醇)。本研究旨在了解黄烷-3-醇合成在特定发育阶段对不同类型的紫外线照射的反应差异，并确定这种反应的潜在机制，最终给出与植物次级代谢物产生的调节有关的新见解。

材料与方法

葡萄品种：

赤霞珠

采样时间：

花后3周(黄烷-3-醇的积累)、7周(黄烷-3-醇合成的结束)和11周(仅合成花青素，但不合成黄烷-3-醇)

采样方法：

在每个阶段，大约2500个浆果从400个完整葡萄的相似位置中选出。任何身体受伤、异常或受感染的浆果都不包括在内。采样时间固定在上午10:00-11:00的。样品被放在泡沫盒中，并在两小时内运送到实验室。浆果用蒸馏水清洗，并在室温下立即用干净的棉布擦干。在紫外线照射之前，所有样品在黑暗中放置约2小时。

紫外照射：

葡萄样品被分成四组，对照一组，UV-A灯(20w；波长在320–400纳米范围内，发射光谱能量集中在365纳米)，UV-B灯(20w；波长在280-320纳米范围内为，发射光谱能量集中在305纳米)和UV-C灯(20w；波长在200-275纳米的范围内，发射光谱能量分别集中在254纳米)。将葡萄浆果分散在灯下方约50厘米处，并暴露于UV-A、UV-B和UV-C光下约20分钟，剂量为1.8千焦/平方米。将置于绝对黑暗中且未暴露于紫外线的浆果作为对照。继紫外线照射后，将紫外线处理过的浆果和对照转移到培育箱(PRX-350D型)中，在25℃和相对湿度为70%的条件下进行暗培育8小时。在0、1、2、4、8和12小时的培育期，分别从箱中取出约180-210个浆果，在液氮中冷冻，并在80℃下储存。

主要实验方法：

RT-PCR和高效液相色谱

研究结果

1 三种类型的紫外线照射不同程度地促进了参与黄烷-3-醇合成的关键结构和调节基因的转录

结构基因VvLAR1、VvLAR2和VvANR在转录水平上被UV-A显著诱导，但不受UV-C的影响，而UV-B仅激活LAR1的转录水平。这些结构基因的转录激活是依赖于时间过程的。UV-A照射的VvANR和VvLAR2以及UV-B 照射的VvLAR1在照射结束时(暗培养开始时)都显示出最高的转录水平，并随着随后的暗培养逐渐下降。UV-A处理的VvLAR1转录水平在暗培养1 h达到最大，随后降低（图2）。紫外线照射抑制VvLAR2的表达（图1）。

图1 原花青素和花青素的代谢途径

图2 三周龄葡萄在不同紫外处理下各基因表达量

与3周龄对照葡萄浆果中的那些相比，7周龄对照样品中VvANR、VvLAR1和VvLAR2的转录水平大大降低。UV-C照射极大地上调了三个结构基因的转录，尤其是VvLAR1和VvANR，其最大转录物丰度分别达到对照的54倍和18倍(图3)。即使在12小时暗培养后，三个结构基因的转录物仍然比对照高至少2倍。UV-A和UV-B照射对VvANR表达也有一定的促进作用，但对VvLAR2几乎不产生明显的促进作用。VvLAR1的表达主要在照射结束后2-4小时内被UV-A照射显著增强，但被UV-B照射增强的很少(图3)。关于这里研究的三个调控基因，它们的表达被UV-C照射显著上调。VvMYB5b和 VvMYBPA1对UV-C的响应趋势相似，梯度为逐渐增加，然后减少，这与VvLAR1和VvANR的UV-C响应趋势平行。VvMYB5a的表达随着暗培养而增加。紫外线照射使VvMYBPA1的转录上调了相应对照的5倍。除此之外，UV-A和 UV-B照射没有对三种转录因子的表达造成显著影响(图3)。

图3 七周龄葡萄在不同紫外处理下各基因表达量

对于转色后的葡萄浆果(开花后11周)，三种类型的紫外线照射都显著上调了VvANR和VvLAR1的表达(图4)。UV-A和UV-B照射也增强了VvLAR2的表达，但远低于VvLAR1。此外，在UV-B处理后2小时，VvLAR2的转录水平迅速下降到对照水平。UV-C 照射几乎没有改变VvLAR2的转录水平(图4)。与结构基因不同，在11周大的浆果中，任何一种紫外线照射对三个调控基因的转录激活都不如预期的多(图4)。

图4 十一周龄葡萄在不同紫外处理下各基因表达量

2 根据发育阶段，三种类型的紫外线照射刺激黄烷-3-醇的产生

随着浆果的发育，UV-A照射的促进作用消失(对于2，3-反式-黄烷-3-醇)或下降(对于2，3-顺式- 黄烷-3-醇)，而UV-B和UV-C照射的促进作用仍有待观察。对于11周大的葡萄，观察到相反的情况。三种类型的紫外线处理似乎都不同程度地抑制了2，3-反式-黄烷-3-醇和 2，3-顺式-黄烷-3-醇的产生(图5)。

图5 三周、七周、十一周葡萄在不同紫外处理下的正式、反式黄烷三醇含量

一个有趣的现象是，三种紫外线照射强烈促进3周龄葡萄中的F3’H途径产生黄烷-3-醇代谢物(ECG + EC + C)和7周龄葡萄中的F3’H产生黄烷-3-醇代谢物(EGC)。相对而言，来自另一个分支的黄烷-3-醇代谢物无论在3周大的葡萄或7周大的葡萄中对紫外线照射的反应都更弱一些。对于11周大的葡萄，紫外照射后反而出现抑制(图6)。

图6 葡萄(赤霞珠葡萄)的皮中(-)-表没食子儿茶素和(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯(ECG)、(-)-表儿茶素(EC)和儿茶素(C)的含量对三种紫外线照射的响应。

3 紫外线照射根据紫外线类型增加葡萄中VvANS和vUFGT 的转录

结果表明，UV-B和UV-C提高了11周龄葡萄中花色苷的含量，而UV-A没有提高。目前的数据显示三种类型的紫外线照射都增强了11周龄葡萄中VvANS和vUFGT的转录。在照射后1–2小时(s)内，UV-B和UV-C照射的增强超过3倍，但对于UV-A照射，实验组数据不到对照组的2倍(图7)。这表明，无论是UV-B和UV-C照射促进合成花青素通过诱导相关基因在转色期后葡萄的表达。

图7 紫外线处理组和相应对照组11周龄葡萄浆果中VvANS和VvUFGT表达量的变化

讨论

到目前为止，紫外线对不同植物中黄酮类化合物的影响已经引起了许多研究，但是研究中的大多数集中在黄烷醇和花青素响应UV-A和UV-B的生物合成和积累上，其中一些是通过结构和调节基因的调节以及产物的积累来进行的。这些研究还推断了可能的机制。

然而，不同紫外对原花青素（PA）合成的研究还不够全面也不够详细。目前的研究产生了主要三个结果。

首先，在特定的发育阶段中，这三种UV不同程度地促进了参与PA合成的三个结构基因和调控基因的转录。无论哪种UV照射，其影响程度都与葡萄浆果的发育阶段有关系。

其次，这三个结构基因的转录促进并不完全受转录因子对紫外线照射的反应所调节。

最后，转色期前的葡萄中观察到2，3-反式-黄烷-3-醇和2，3-顺式-黄烷-3-醇的含量增加与它们的结构基因响应紫外线照射后的表达上调之间呈现良好对应关系，而在转色期后的葡萄中并没有观察到。

太阳紫外线辐射是一种非常重要的动态非生物环境因子，它是植物生长和分化过程的重要影响因素。当植物被超过环境含量的紫外照射时，果皮中会产生一些保护物质，如类黄酮和羟基肉桂酸，以保护植物免受伤害。在本研究中，额外的紫外线照射对结构基因的转录产生促进作用，紫外线照射也在转录水平上调了全部或部分调控基因。此外，对于幼浆果，紫外的激活作用主要出现在处理后的前两小时内，而对于转色期后的浆果，这种促进作用在紫外照射后的8小时内仍然存在。这表明黄烷-3-醇合成相关基因(VvANR、VvLAR1和VvLAR2)在对紫外-A或紫外-B辐射的反应中的表达高度依赖于葡萄果实的发育期。

UV-C实验组的结果几乎不变，甚至降低了3周龄浆果中三个结构基因的转录，但在7周龄和11周龄浆果中可以观察到UV-C辐射引起的转录激活。提示幼果不能承受UV-C的高能量。有报道提出，葡萄浆果中紫外线照射诱导的白藜芦醇生物合成与植物的发育阶段密切相关，只有在未成熟浆果中，紫外线照射才能极大地影响STS转录物。

先前的研究提出，黄烷-3-醇在开花后的早期发育阶段合成，黄烷-3-醇一直增加直到转色期。上游合成途径常见于花青素和黄烷-3-醇。下游途径在转色期之前进入黄烷-3-醇和黄酮醇生物合成的分支，然后，在转色期进入花青素生物合成的分支。在这项研究中，在开花后的第11周，花青素发生了快速积累，紫外线照射对VvANR和VvLARs的转录促进并未导致11周果实中黄烷-3-醇含量的增加，这一事实可能归因于缺乏用于生产花青素的上游底物。有趣的是，这三种类型的紫外线照射主要提高了3周龄果实中F3’H分支途径上黄烷-醇成分，并大部分增强了7周龄中F3’5’H分支途径(见图6)。这意味着在葡萄浆果发育的不同阶段，紫外线辐射选择性地诱导F3’H和F3’5’H分支影响VvANR和VvLAR的表达。

近年来，关于紫外辐射诱导的反应机制有两种观点，主要来自对类黄酮途径的研究。首先，编码苯丙氨酸和类黄酮途径中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查尔酮合酶(CHS)的启动子，具有相似的包含G-box序列的光响应元件，响应紫外光，导致PAL和CHS基因的诱导表达；其次，参与类黄酮途径的一系列基因的启动子含有一个特定的识别结构域，该结构域可以与MYB转录因子相互作用，这些调节基因可以被紫外线照射激活，从而导致结构基因的转录激活。关于此处研究的结构基因，先前已有报道，VvANR和VvLAR1 的启动子包含MYB转录因子核心DNA结合位点的共有序列。此外，Fujita等人已经使用PLACE植物顺式作用调节DNA元件的数据库)进行了同源性搜索，并在VvLAR1和VvLAR2的启动子中发现了预测的光响应顺式作用调节元件。结果表明，VvLAR1和VvLAR2的启动子具有某些类型的光响应顺式作用元件:GT-1位点、I-box、TGACG基序和GATA盒。VvANR的启动子也有一个G盒、四个GT-1位点和四个GATA盒。Gollop等人使用相同的数据库搜索了VvANS的启动子，发现存在G- box和GT-1位点。因此，VvANR和VvLAR 1 启动子中的光应答顺式作用元件和MYB 转录因子的核心DNA结合位点的存在可能解释了我们从这项工作中获得的结果：在一种特定类型的紫外线照射后，一些结构基因显示出与调控基因相似的表达模式，而其他基因则没有。然而，有些问题仍然不清楚。比如，为什么这些结构基因或调控基因的转录激活依赖于UV和发育阶段？这些将是未来需要研究的方向。