【文献解读】鱼类营养研究中评价肠道健康的组织形态计量学的规划和报告——提高研究可比性的建议
发布于 2021-09-13 07:27
在不同的饮食因素下，所有动物的肠道都会表现出显著和快速的功能和结构变化。因此，组织形态计量学可以定量或半定量地评估任何饲料成分对器官微观结构的整体影响，同时也可以很好地指示其对肠道功能的影响。
与其他方法一样，肠道组织形态计量学有许多步骤，从采集合适和充足的组织样本开始，到测量结果的统计分析。本文目的不是对所包括的所有步骤进行详细讨论，而是就鱼类营养研究中常用的组织形态计量学评估的规划和报告的要点提出建议。基于这些建议并遵循ARRIVE（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments）指南，表1提供了一份清单，供作者考虑，以增加研究的可比性，并最终提高研究的可重复性。
表1 鱼类营养研究中肠道组织形态计量学规划和报告清单
一般来说，肠道组织样本是在试验开始时和之后的不同时间点采集的。一条很少被提及的重要信息是，如何决定每组抽样动物的数量。这一点在ARRIVE指南中得到了强调，被包括在许多相关立法中，甚至是关于将这些动物用于研究的申请中的一部分。由于这些数字也与观察到的处理之间的差异（或缺乏）有关，因此在方法和结果中应始终包括能量分析。该分析还将表明哪些差异是作者认为有意义的（例如，效应大小）。
另一条也很少被提及的信息是，收集与最后一次喂食有关的组织样本。由于即使是24小时的短期饥饿也会对肠道的微观结构产生影响，如果可能的话，这段时间应该经常报告并标准化。
有一件事似乎经常引起许多作者的不同意见，那就是不同肠段的确定。在观察鱼类的肠道时，大多数情况下，该器官在形态上不像哺乳动物的肠道那样容易分成不同的节段。然而，从肠道前端到后端，有不同的功能，在显微镜下，至少可以区分出三个不同的节段，即前肠、中肠和后肠。例如，与功能相关的微观结构上的主要差异包括肠道绒毛高度的差异（向后肠方向减少）和杯状细胞数量的差异（向后肠方向增加）。前肠、中肠和后肠比例的确定主要与鱼类的种类有关。然而，即使对于同一物种，不同的作者使用不同的方法来区分不同的节段，有时甚至没有说明用于这一定义的标准。例如，Wallace等人在斑马鱼中指出的后肠比Wang等人所指出的要短得多。在鳟鱼中，前肠通常被认为是幽门盲囊的部分，但有时也可能是幽门盲囊后面的区域。由于肠道的长度也可以与鱼类个体的整体大小相关，因此，最好再次基于分段的实际功能，将分段表示为整个长度的百分比。在方法中应明确说明根据研究范围进行调整的理由。
对于任何组织形态计量学评估，公正地选择足够数量的包含适当肠褶的观察区域是很重要的。不同的作者使用不同肠段的纵向或横截面。正如Gava等人对肉鸡肠道进行形态计量学分析得到的结论，尽管在鱼类中发表的信息有限，但似乎闭合肠段的纵向切面更合适。也可以使用横截面，但是需要更多的横截面来提供整个肠段长度的统计代表性图像，特别是与病变情况相关的图像（也就是说，这是多灶性肠炎还是弥漫性肠炎，延伸到整个肠段？）。在任何情况下，在方法中都应明确提到选择组织切片数量和切片内观察区域的标准，特别是与肠段的预期变异相关的标准。
半定量组织形态计量学评估是对许多组织样本进行快速筛选的一种简单方法，特别是在试点研究中，但它严重依赖于观察者的培训/经验，而且必须满足某些标准。另一方面，定量组织形态计量学提供了一组清晰的测量或计数，几乎不需要观测者的经验。这里的关键是，如前所述，测量应该代表整个肠段。例如，在已发表的对鲑鱼中豆粕引起的肠炎的最基本的形态计量学评估之一中，没有提到肠炎是否均匀地影响到整个后肠以及这样使用每条鱼3-4个横截面提供的结果的代表性如何。对于半定量和定量评估，在切割和适当染色后，用光学显微镜观察组织切片。拍摄适当观察区域的照片，并使用专门的图像分析软件进行评估。对于半定量评估，对于所选的每个描述性指标，建议采用一个任意的评分系统（例如，从1到5），而对于定量评估，则对某些指标进行测量/计数。在这两种评估中，许多观察区域是任意选择的，并且根据数据类型的不同，每只动物都报告了这些观察区域的平均值或中位数。
不同研究中指标的选择，特别是半定量方法、评分系统的描述和范围的选择，可能是不同研究中出现最大差异的问题所在，使它们成为降低研究之间可比性的最关键因素。以大豆相关研究为例，以下采用半定量肠道组织形态计量学的研究可以证明这种差异。（1）Kokou等人使用9条鱼/处理，5个指标，每个指标3分；（2）Liu等人使用6条鱼/处理，3个指标，每个指标5分；（3）Venold等人使用12条鱼/处理，8个指标，每个指标10分。虽然这三项研究都提供了有趣的结果，并成功地发现了不同处理方法之间的一些差异，但它们并没有证明所使用的鱼的数量是合理的，也没有说明为什么他们选择了特定的指标和评分系统，以便于他们的结果可以很容易地与未来的研究进行比较。关于评分系统，Ward和Thoolen建议使用的指标应该是可定义的、可重复的，并且应该具有与所研究的学科相关的价值。评分范围最好在4到5之间，以保持合理的灵敏度水平，同时保持良好的重复性。应该避免经常出现在出版物中的常见描述，如“正常尺寸”、“增大尺寸”和“较大尺寸”。任何修改都应该是合理的，因为它们会影响研究之间的可比性。
鱼类营养研究中最常用的组织形态计量学指标是：（1）肠道绒毛的形态和高度，（2）肠上皮细胞的高度，（3）杯状细胞的数量和大小，（4）固有层和黏膜下层的厚度，（5）肌层的厚度，（6）肠上皮细胞核上空泡，（7）上皮细胞或固有层和黏膜下层中各种炎症细胞（例如，淋巴细胞）的鉴定（通常使用免疫组织化学）。一些作者使用的其他指标还有：分形维数分析（研究肠道黏膜的结构复杂性）和微绒毛的形态和密度。在鱼类营养方面，使用上述指标的目的是评估任何实验性饲料对肠道整体健康状况和炎症发生的影响。此外，这种评估将支持其他观察结果（如生长性能），并间接表明肠道对可能出现的其他因素（如各种病原体）的反应能力。然而，关于它们的使用有一些注意事项。
在哺乳动物大多数类型的肠炎中都可以观察到一些共同的发现，如各种炎症细胞对肠壁的浸润增加(最初在黏膜，然后是黏膜下层)、上皮细胞增殖、杯状细胞的数量和大小的变化以及绒毛形态的变化。因此，在鱼类中，以前列出的大多数指标都被认为是相关的，正如许多关于植物饲料成分引起的肠炎的出版物证明的那样。然而，在鱼类研究中没有清楚显示的是，观察结果何时变得有意义，而不仅仅是统计上的不同。例如，在鱼类中，似乎取决于实验设计，生长和形态测量指标并不总是相关的，如Egerton等人和Najafabad等人所观察到的。但应该指出的是，在这两项研究中，指标都是单独评估的，这可能会降低对器官整体评估的强度，如下所述。对于未来的研究也至关重要的是，研究应该包括相关性评估，以证明指标与研究范围的相关性，理想情况下，应设置阈值，超过阈值的数值/评分就有意义，例如，这在人类医学中很常见。
对于这两种评估方法，指标的值要么以单独的分数表示，要么以单个指标的总分/平均分表示。如果对特定的层次/细胞感兴趣，第一种方法可能更合适，而第二种方法似乎更适合给整个器官一个具有代表性的分数，因为这是由不同的成分/结构组成的。在这种情况下，如果在任何总分或平均分变得有意义之前确定每个作出贡献的指标的重要性或“权重”，则评估的准确性就会得到提高。
如果我们以大豆诱发的鲑鱼肠炎为例，那么早期的改变包括：黏膜皱褶缩短、肠上皮细胞空泡化减少以及上皮细胞、固有层和黏膜下层的炎症细胞浸润增加。正如Urán等人和Sahlmann等人所证明的那样，根据包涵体水平的不同，这些变化甚至可能在几天内出现，随后杯状细胞的数量和形态也会发生变化。应该指出的是，在上述两篇论文中，每个时间点的每次处理取样4-5条鱼，因此更高的样本量可能会更早地显示出早期迹象。特别是对于杯状细胞的情况，还应该注意的是，各种压力因素的慢性影响可能导致杯状细胞的丢失，因此，如果仅在长期处理后进行评估，则其评估可能不会那么有效。因此，当任何组织学变化的发展情况尚不清楚时，应使用多个采样点来指示这种情况的进展并支撑研究结论。
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