高水平文章解读丨经典自噬蛋白LC3与外泌体内含物-RNA结合蛋白分泌的调控机制

发布于 2021-09-27 16:31

编辑丨Van

AutophagyAdvances

自噬是细胞细胞器和蛋白质周转的一种细胞内稳态程序，在外界压力、饥饿、缺氧和内质网应激等特殊情况下，自噬启动负责清除错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等，对于维持细胞稳态起着重要作用。首先在上游信号的影响下会形成吞噬泡，膜的扩展主要涉及两个泛素样结合系统（ATG12和LC3）。ATG12以需要ATG7和ATG10(分别为E1和E2样酶) 的泛素样反应与ATG5偶联。然后，ATG12–ATG5 连接物与ATG16 非共价反应形成更大的复合物从而调节吞噬体膜的弯曲，并且这个复合体可以激活ATG3的酶活，促进lC3II脂化。LC3/ATG8的 C 端（羧基末端）被ATG4蛋白酶酶切后生成细胞质形成的LC3-I。LC3-I与磷脂酰乙醇胺(PE)也以泛素样反应的方式连接，这个反应需要ATG7和ATG3(分别为E1和E2泛素样酶)。 LC3的脂质形式，即LC3-II，吸附在自噬体膜上。P62作为货物接头，将货物带到自噬体内，最后自噬体与溶酶体融合完成对包裹货物的降解。

外泌体属于细胞外囊泡，细胞外囊泡携带有胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、神经节苷脂等脂类物质，并富含多种蛋白质和RNA等生物活性物质，在细胞间信号通讯中有重要作用，参与细胞存活和凋亡，血管新生，血栓形成、炎症免疫反应等。在生理状态维持和疾病的进程中发挥重要作用。随着近些年研究的不断深入，发现细胞外囊泡还在纤维化、自噬、免疫抑制及免疫激活等多方面发挥作用。细胞外颗粒根据其生物合成分为外泌体，微囊泡、凋亡小体、高密度脂质粒子、低密度脂质粒子。而细胞外囊泡是前三者。

那么外泌体又是如何形成的？内吞作用和高尔基体分泌将不同货物分拣到早期内体中，然后，早期内体被认为在运输所需的内体分选复合物（ESCRT）作用下内化并形成 ILV（腔内小泡），以形成成熟的MVB（多囊泡体）。错误折叠的蛋白质、信号受体和相关因子被分类到MVB中，随后在溶酶体中降解来维持细胞内物质平衡和稳态。并且MVB还可以选择性地装载特殊物质（脂质、蛋白质和核酸），然后与细胞质膜融合以释放其外泌体。ESCRT依赖机制 ALIX和ESCRT-I/ESCRT-II直接参与膜出芽，ESCRT-III和AAA-ATP酶VPS4随后从细胞质中切下芽形成ILV。ESCRT非依赖性ILV的生物发生涉及神经酰胺诱导囊泡弯曲和出芽的机制。蛋白脂蛋白被转移到内体膜上不同的亚区，然后外泌体相关的区域以ESCRT不依赖的方式转移到管腔内，这也需要鞘磷脂神经酰胺。虽然自噬经典地被认为是溶酶体的降解过程，但遗传证据表明，分泌物中含有自噬途径成分(ATGs)，包括常规的炎性细胞因子的分泌、溶菌酶的细胞外释放、分泌性溶酶体的有效出口、EV的产生以及缺乏氨基末端前导肽或信号序列的蛋白质的非常规分泌，这些过程统称为分泌性自噬。首先，除了数量有限的蛋白质靶点外，依赖自噬的分泌体仍然没有特征性。此外，迄今为止的研究在很大程度上依赖于ATG基因功能丧失后的表型分析，未能辨别分泌缺陷是否代表自噬受损的直接或间接后果。

自噬经典地被认为是降解货物的途径，随着近些年来外泌体研究的增多以及在分泌物中发现自噬成分（ATG），很多人开始研究分泌型自噬。接下来，我们一起了解一下发表于Nature Cell Biology上的这篇文章，文章题为“The LC3-conjugation machinery specifies the loading of RNA-binding proteins into extracellular vesicles”。这篇文章描述了一种分泌型自噬途径，在此途径中，LC3介导蛋白质和RNA货物装载到EVS中，以便在细胞外分泌。

1. LC3邻近依赖生物素化标记通过依赖自噬途径分泌的蛋白质

作者发明了一种策略来标记自噬中间体的蛋白，BirA是大肠杆菌中的一种生物素连接酶，它可以将靶蛋白生物素化，首先结合生物素与ATP形成生物素腺苷酸，这种活化的生物素被保持在BirA活性位点内，紧接着与BAT(生物素受体标签）序列的赖氨酸残基反应。而BirA突变体R118G能够从活性中心释放中间产物生物素腺苷酸。从而导致邻近的蛋白被生物素化。由于低浓度和高水解速度，远离BirA突变体的蛋白基本不会被生物素化。因此BirA突变体可以对邻近蛋白或相互作用的蛋白质进行生物素化。因此生物素可以结合到生物素连接酶与LC3融合蛋白上，蛋白随后分泌到细胞外。可以从图b发现与Bira*对照相比，在BirA*-LC3稳转细胞的CM中检测到了许多独特的生物素标记蛋白。从c图可以发现链霉亲和纯化下来很多与LC3相互作用的细胞内蛋白，但是这些蛋白却并没有分泌到条件培养基(CM)中。

然后将一策略与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)相结合，作为一种定量蛋白质组学方法，通过质谱(MS；图1d)检测BirA*-LC3和BirA*之间分泌蛋白丰度的差异。如图d，轻重链的精氨酸和赖氨酸在生物素孵育24h后离心收集CM，在三氯乙烯中沉淀CM并重新溶解，以1:1混合cm蛋白，然后链霉亲和树脂亲和纯化，最后用二级液相质谱进行肽鉴定和定量。在三个独立重复实验中鉴定出大于350个分泌蛋白。候选蛋白是根据显著增加的log2(BirA*-LC3/BirA*)比率和存在两个或更多肽来选择的。在所有3个重复中，共有31个蛋白质显示出显著的富集(log2(BirA*-LC3/BirA*)>1；P<0.05)，另外170个蛋白质在3次独立重复中的2次重复中富集(图1e-g和扩展数据图2a)。作者将三次重复都富含的称为I类蛋白，将三次重复中出现两次的称为II类蛋白。在I类中鉴定了两个自噬蛋白MAP1LC3B和ATG3以及多个能与LC3或其他ATG8家族相互作用的RBPs。

d图可以看出五个LC3家族成员在与所识别的分泌靶点相关的蛋白质中排名靠前。在BirA*-LC3标记的分泌组中富集的蛋白质中，有83%先前在人血浆的蛋白质组学中被鉴定出来，这与自噬在控制体内分泌方面的作用是一致的(图1h)。基因本体(GO)分析表明，BirA*-LC3标记的分泌组高度富集了外囊泡释放的RBPs和蛋白质(图1i和扩展数据图2e)；在蛋白质组筛选中发现的候选蛋白质中，有33%是以前在外泌体中检测到的，200个蛋白质中有113个具有mRNA结合功能(扩展数据图2e-g和补充表1)。综上所述，这些结果表明LC3和自噬机制控制着EVS中特定蛋白(如RBPs)的装载和分泌。

2. LC3-II和BirA*–LC3生物标记的靶标在小细胞外囊泡中分泌

从生物素孵育的BirA*-LC3细胞中提取的CM经连续差速超速离心，回收剩余样品中的大EVs(10000g)、小EVs(100000g)和TCA（可溶性蛋白）。BirA*-LC3标记的分泌蛋白在100000 g颗粒中与多个EV标志物共同富集(图2a，b)。100000g组分也富含脂化的、膜结合的内源性LC3(LC3-II)，这表明LC3-II本身是通过EVS分泌的。通过线性蔗糖密度梯度进一步纯化EV，作者发现内源LC3-II在特征浮力密度下与定义明确的EV标记共分级，在密度较低的馏分中分布略宽(图2c)。透射电子显微镜(TEM)进一步证实，通过超速离心分离的样品富含EVs。重要的是，内源性LC3-II存在于EVS的管腔内，在没有洗涤剂的情况下，它的蛋白酶保护作用证明了这一点，并与EVS共同纯化，EVS是从使用EV相关四肽抗体的浓缩制剂中免疫分离出来的(图2d-f)。

最后，LC3-II在多种细胞类型的EVs内分泌，包括原代星形胶质细胞，并在从小鼠血浆中分离的EVs体内检测到LC3-II(扩展数据图3a-g)。那么前面说到EVs的一个子集是由多囊泡小体(MVB) 的限制膜的腔内萌发产生的。为了确定细胞内LC3是否定位于MVB，作者使用了APEX-LC3重组探针通过TEM显示LC3，Apex（抗坏血酸过氧化物酶）会使DAB形成聚合物从而被OsO4着色,结果显示许多MVB含有LC3阳性的腔内小泡(ILV) (图2g)。

为了确定内源性LC3是否被运送到MVB的管腔内，作者在表达组成型活性突变体mCherry-Rab5Q79L的细胞中进行了LC3的免疫组化染色，该突变体损害了内体转运，并促进了管腔内发芽的扩大和早期内体的形成，作者在野生型(WT)细胞的mCherry-Rab5Q79L内体限制膜和ILV中检测到内源性LC3，但在ATG7缺失的细胞中未检测到内源性LC3，ATG7是LC3脂化所必需的自噬调节因子(图3a)。此外，LC3与CD63在这些扩大的囊泡中间体中共定位(扩展数据3h)。相反，ATG14(经典降解自噬所需的ATG)并不能减少mCherry-Rab5Q79L内体中阳性LC3ILV的形成(图3a)。最后，在没有Rab5Q79L表达的情况下，作者观察到内源性LC3和CD63有显著的共定位，进一步表明LC3是通过ATG7依赖而不是ATG14依赖的途径在EVs中装载和释放的(图3b-d)。

3. EV装载和分泌RBPs需要LC3偶联途径

ATG7和ATG14缺失的表型差异表明LC3结合机制特异性的将蛋白质包装到EV中以便在细胞外分泌。为进一步阐明LC3依赖性EV蛋白组，通过串联质量标记（TMT）的定量蛋白质组学，作者比较了野生型和ATG7或ATG12缺失的EV。总之，81%的富含BirA*-LC3B标记的分泌蛋白组在全部EV蛋白组中检测到，说明EV是自噬依赖性非常规分泌的主要途径。相对于ATG7和ATG12缺陷细胞（图4c和补充表2），来自WT的EV中共有815种蛋白质富集，包括55种与BirA*-LC3B标记的分泌蛋白组重叠的蛋白质，例如RBP，SAFB、HNRNPK、LARP1、SF3A1和G3BP1。此外，对于BirA*–LC3分泌组，基因本体（GO）分析强调了在RNA代谢中起作用的RBP和蛋白质的大量富集（图1i和4e）。

SAFB和HNRNPK的分泌是否需要不同的自噬途径成分？与对照相比，缺失LC3结合途径组件ATG7和ATG12降低了EV的总体产量和蛋白质含量(图5d)，但不影响EV的大小(图5e)。为了控制ATG缺失细胞间EV产生的这些差异，作者在蛋白质浓度的基础上对EV裂解产物进行了归一化，并检测了LC3结合的RBPs。ATG7和ATG12缺失细胞的EV缺乏LC3-II、HNRNPK和SAFB，但仍含有EV标记蛋白(图5f，g)。同样，在ATG3缺失的细胞中观察到这些靶点的EV分泌减少，分泌受损并不是因为细胞内的SAFB和HNRNPK蛋白水平变化或者细胞死亡。相反失去ATG14和FIP200不会减弱EV的产生或EV释放的LC3II和LC3结合的RBPs。因此结果证明将LC3II和LC3结合的RBPs装载到EVs中对LC3结合机制有特定的要求。

为了进一步证明这一点，在系统缺失ATG12小鼠内，LC3II在血浆的EVs中不分泌（拓3b-d）。与LC3结合的蛋白质经常包含一个称为LC3相互作用区(LIR)的基序，作者调查了LC3结合RBPs装载到EVS中是否涉及LIR依赖的相互作用。初级序列分析显示，SAFB内有一个假定的LIR共识基序(扩展数据图5D)，而HNRNPK只包含最少重叠的区域。该基序中的核心疏水氨基酸突变为丙氨酸(F199A)足以破坏LC3结合(图4h，i)，从而有效地抑制SAFB的EV分泌(图4j，k)。

总之，这种分泌型自噬途径，作者称它为LC3依赖性EV装载和分泌（LDELS），不同于经典自噬。为了支持这一点，用雷帕霉素处理细胞刺激经典自噬，但是却反过来减少了EVs分泌的LC3II和LC3结合RBPs。（拓4ij）此外，其他LC3家族成员也通过LC3结合机制在EVs中释放。（拓5a）最近的无偏蛋白质组学分析在不同细胞系的EVs中检测到多个LC3家族成员。值得注意的是，作者证实了从蛋白质组筛选中发现的另外RBPs，包括G3BP1、LARP1和SF3A1(它们以ATG7依赖的方式在EVs中分泌)；类似于SAFB和HNRNPK，这些蛋白与不同的LC3家族成员相互作用(扩展数据图5b，c)。总之，这些数据表明，LC3结合机制和LC3家族蛋白通过EVs介导RBPs的货物装载和的分泌。

4. LDELS通过EVs调控细胞外RNA的分泌

作者进一步推测LDELS通过EVs影响细胞外RNA的分泌，EVs包含不同的核酸（mRNA,非编码RNA和DNA），但是将遗传物质载入EVs的机制仍不清楚。为了研究LDELS如何影响细胞外RNA分泌，作者对分离自WT ATG7和ATG12缺失的细胞EV样本进行RNA定量测序，评估基因表达差异。作者发现EV中小RNA有很大差距，而细胞内的小RNA差距很小。（6a b）

来自ATG7和ATG12缺陷细胞的EV的RNA测序发现小核仁RNA(SnoRNAs)和microRNAs(MiRNAs)较少。特别是在ATG7敲除条件下。WT细胞EV中snoRNAs和miRNAs分别占EV小RNA序列的23%和15%，而ATG7缺陷细胞的SnoRNAs和miRNAs分别占EV小RNA序列的6%和5%，ATG12缺陷细胞的SnoRNAs和miRNAs分别占18%和5%。来自LDELS缺陷细胞的EV中snoRNA和miRNA序列水平的降低与tRNA种类比例相对增加相关。相反，ATG7/12缺失对EVS内大RNA的细胞外释放影响最小(扩展数据图5e-g和补充表3)

更详细的分析显示，相对于ATG7和ATG12缺陷细胞，252和105个小的非编码RNA分别在WT中EV中显著富集(红色点）(图6c，d)；这两个数据集之间的重叠突出了88个不同的RNA，这些RNA需要LC3偶联机制才能有效地在EV中分泌(图6e和补充表3)。最重要的是，由LDELS调控的EV非编码小RNA中有76%是snoRNAs(或其片段)，这是一类典型的参与核糖体RNA修饰的小RNA (图6f)。此外，30%的snoRNAs以ATG7/12依赖的方式分泌，相对于细胞总RNA在EVs中富集，这与它们通过活性包装机制整合到EVs中是一致的(图6g)。因此，LDELS影响EVs内分泌的细胞外小非编码RNA种类。

5. LDELS需要nSMase2

前面研究表明LDELS介导RBP和RNA装载到EVS中分泌，那么它受谁调控？促进MVB限制膜向内萌发和ILV形成的途径是否有助于LDELS。虽然最具特征性的过程涉及转运所需的内体分选复合物(ESCRT)，但针对大多数ESCRT成分的短干扰RNA(CHMP4b)未能阻止内源LC3掺入mCherry-Rab5Q79L内体(扩展数据图6a-c)。同时，作者评估了SMPD3(也称为nSMase2)产生的神经酰胺诱导小泡弯曲和从MVB向内萌发的另一种途径。事实上，siRNA介导的nSMase2的耗尽在功能上损害了内源性LC3在mCherry-Rab5Q79L内体中的掺入(扩展数据图。6a、d)。

此外，用nSMase2催化抑制剂GW4869或针对nSMase2的短发夹RNA(ShRNA)处理有效地抑制了LC3-II和LC3结合RBPs的分泌(图7a-d和扩展数据图7a，b)。

既然nSMase2能够影响LC3II和RBPs在EV中的装载，那么调节nSMase2活性和货物选择的机制是什么呢？细胞内LC3和ATG8家族相互作用的生物信息学分析确定中性鞘磷脂酶激活相关因子(NSMAF；也称为FAN)是一种潜在的nSMase2LC3相关调控因子。事实上，FAN与包括LC3B在内的多种LC3亚型强烈的相互作用，但本身并不会通过自噬降解（7e 补充7d），此外FAN敲低抑制了LC3IISAFB HNRNPK的EV分泌，而经典自噬没变化。（7f,g补充7e）