什么是RT-qPCR? ---RNA一站式解决方案

RT-qPCR包括三大步骤：RNA的提取与质量检测、逆转录成cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验，可以合成cDNA探针、获取目的基因、以及分析基因的转录水平。

RNA的提取与质量检测

从细胞、组织等样本中提取出RNA后，需要对提取的RNA的纯度、浓度、以及完整性进行评估，质检达标后才能进行后续的实验。一般需要通过紫外分光光度法（Nanodrop仪器）检测RNA的浓度和纯度；Agilent 2100仪器分析RIN值检测RNA的完整性；以及琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有基因组污染和其他杂质污染。

1.RNA的浓度&纯度检测（吸光度法）

由于RNA具有共轭结构，可以吸收紫外光，故测定RNA溶液在260 nm的吸光度值，可计算出RNA的含量。其中纯度高的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀比值应在1.9~2.2之间，若比值＞2.2，表明可能有异硫氰酸，若比值<1.9，表明有蛋白质、酚等污染；建议重新提取RNA。

2.RNA完整性检测（Agilent 2100分析）

RIN值大小反映样品的完整性，一般RIN值在5~10之间，数值越接近10表明RNA完整性越高，反之RIN值越小完整性越差（特殊样品需结合基线综合评估）。Agilent 2100检测不仅可以得到样品RIN值，还可以得到样品浓度以及28S/18S比值（原核生物是23S/16S）。

图1：RNA完整性指标

3.基因组及其他杂质污染检测（凝胶电泳）

真核生物RNA特有28S、18S、5S三条带，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，28S条带的亮度大概是18S条带的两倍或者以上，且无拖尾，说明RNA的完整性高、未被其他杂质污染。若出现其他条带、或者条带弥散拖尾，建议重新提取RNA。

图2：真核生物完整的 RNA 琼脂糖凝胶电泳图

总之，RNA提取的原则：

①　保证RNA一级结构的完整性；

②　不存在对酶存在抑制作用的有机溶剂，以及过高浓度的金属离子污染；

③　其他蛋白质、多糖和脂类污染；

④　排除其他核酸分子（DNA、游离核苷酸等）污染。

产品名称：植物RNA提取试剂盒 Biomarker Plant Total RNA Isolation Kit (Polysaccharides&Polyphenolics–rich)

目录: RK02004

规格: 50 RXN

产品特点：专门针对多糖多酚或高淀粉植物组织提取RNA

实验数据：RNA提取凝胶电泳图

图3：提取50 mg不同组织中的RNA。Lane 1：番茄果；Lane 2：南瓜叶；Lane 3：玉米根；Lane 4：南瓜茎；Lane 5：丝瓜花；Lane 6：水稻种子。

除此之外，百迈客公司还提供动物常量RNA提取试剂盒（目录:RK02009

规格: 50 RXN，数据查看链接：https://mp.weixin.qq.com/s/HNp3yFve6AEi3wykngJLlg），可以从细胞、动物组织、幼虫等样本中提取纯度高的RNA。

以及微量细胞组织RNA提取试剂盒（目录:  RK02010 规格:  50 RXN，数据查看链接：https://mp.weixin.qq.com/s/5IYa1MNpQA030OnH_OSeig），可以从~5 mg的细胞、组织样本中，快速（20 min内）提取纯度高的RNA。

逆转录

cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。提取完组织或细胞中的总RNA后，以其中的mRNA作为模板，利用逆转录酶逆转成第一链cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中获得目的基因的策略之一。

逆转录PCR重要参数

不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同；因此，选择合适的逆转录酶、二价阳离子、dNTP、引物的选择等非常重要。具体参数如下：

1.逆转录酶

目前市场上有两种不同的逆转录酶，一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H活性，它最适温度是42 ℃，最适pH 8.3。但是高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。

另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)的逆转录酶，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37 ℃，最适pH 7.6，较弱的RNA酶H活性，可扩增2-3 kb的cDNA。

2.单价阳离子

离子条件基本上影响各种模板的转录效率。K⁺的转录产物比Na⁺较长。对于cDNA长度的最适K⁺浓度为140-150 mM。

3.二价阳离子

对于反转录酶活性来说，二价阳离子也是必需的。产生全长cDNA产物的最适浓度是6-10 mM。

4.dNTP

四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度，对于有效合成cDNA是至关重要的。如果其中只有一种的浓度小于10-50 μM，cDNA的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-500 μM。

5.引物的选择

逆转录引物一般包含三种：oligo dT，Random Primer Mix和特异性引物。客户可以根据个人需求进行选择。

注意事项 

1.cDNA第一链合成的反应液需要冰上配制。

2.高纯度、完整性好的RNA对于RT-PCR检测至关重要。

3.Oligo-dT引物对于大多数应用是首选的，因为它确保所有cDNA拷贝终止于mRNA的3' 末端并可获得最高产量的全长cDNA。

产品名称：BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit

目录: RK02002

规格: 100 RXN

产品特点：高反转录酶的活性、热稳定性强、可扩增长达10 kb的cDNA

实验数据：以cDNA为模板，进行PCR扩增的凝胶电泳图

图4：以1μl人肝癌细胞RNA为模板，用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，得到cDNA产物。再以100 ng cDNA为模板，用Biomarker HS 2× HF Master Mix进行PCR扩增，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果所示：扩增条带单一且产量高。

实时荧光定量PCR

荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是通过检测DNA双链结合的染料，是 SYBR® Green I对DNA扩增过程中的起始量进行定量监测的技术手段。qPCR实验结果包含扩增曲线和溶解曲线。

1.

扩增曲线

1）正常的扩增曲线一般呈S型、有明显的四个时期，C_t值在20-30之间，且复孔的C_t值尽量一致，相差不要超过0.5个C_t值（上限是1个C_t值）；

2) 同一个基因在不同浓度的相同模板下扩增，其相差的C_t值为相差浓度倍数的2次方。

3) 另外阴性对照不能有扩增（40个循环以后出C_t值属正常现象，也可算作没有扩增）。

图5：扩增曲线

2.

溶解曲线

1）溶解曲线是为了验证扩增产物特异性，一般是单峰，和模板的浓度无关。

2）一般SYBR法的目的基因在80~90 ℃之间。

3）若出现其他峰，可能是引物二聚体导致需要优化引物序列、引物加量等因素。

图6：溶解曲线

注意事项

(1) 请确保引物的正确性和特异性。通常引物终浓度0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1~1.0 μM范围内调整引物浓度。

(2) 扩增产物的长度建议选择在70~200 bp范围内。

(3) 梯度稀释模板，并依次建立标准曲线。

(4) 建议20 μL反应体系中加入1 pg~100 ng的DNA为模板，并设计无模板对照(NTC)。

(5) 为确保实验重复性，建议每个样品和对照组设置3个复孔。

产品名称：Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix

目录:  RK02001

规格:  500 RXN

产品特点：兼容性完美，全平台通用；灵敏度高，可检测低至10 pg的模板。

实验数据：qPCR扩增曲线

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文：Alice Li

排版：市场部

 

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