(文献解读:王银)STAT1在Caspase-8上游的胃肠道感染过程中协调肠道上皮细胞的死亡

论文题目：STAT1 coordinates intestinal epithelial cell death duringgastrointestinal infection upstream of Caspase-8

第一作者：Stolzer, Iris

通讯作者：Guenther, Claudia

研究单位：Univ Klinikum Erlangen & Friedrich Alexander Univ

发表期刊：MUCOSAL IMMUNOLOGY

发表年份：2021年

影响因子：7.313

DOI：https://doi.org/10.1038/s41385-021-00450-2

摘要

肠道内稳态和肠道上皮屏障的维持是鼠伤寒沙门氏菌感染过程中宿主防御的重要组成部分。两者都需要严格控制细胞死亡。然而，调控上皮细胞死亡的分子途径尚不完全清楚。在这里，我们阐明了调控细胞死亡的中枢机制和上游调控成分在胃肠道感染中的作用。小肠上皮中缺乏Caspase-8的小鼠对细菌诱导的肠炎和肠道炎症高度敏感，导致这些小鼠的致命性增强。这种表型与沙门氏菌感染期间STAT1激活增加有关。在Casp8ΔIEC小鼠中，STAT1的额外缺失消除了细胞死亡、屏障破坏和全身感染。在上皮细胞STAT1缺失的情况下，上皮细胞的缺失被消除，并伴有Caspase-8的激活减少。在机制上，我们证明了上皮细胞STAT1在caspase -8依赖和非依赖的细胞死亡的上游起作用，因此可能在肠上皮中几个中央细胞死亡通路的十字路口起主要作用。综上所述，我们发现STAT1的转录控制是维持肠道屏障功能和宿主生存所必需的宿主反应机制。

引言

肠道沙门氏菌是一种常见的胃肠道病原体，在世界范围内引起严重的人类食源性疾病¹。血清伤寒沙门氏菌感染可导致急性、自限性肠道炎症，并伴有腹泻、呕吐和腹痛²。沙门氏菌等病原体在肠道内定植和入侵的能力受到多种因素的控制，包括共生菌群、免疫系统和肠道上皮屏障。为了进入潜在的免疫系统和宿主循环，病原体必须征服上皮细胞。因此，沙门氏菌感染的特征是在早期感染期间，黏膜组织内特别是肠道上皮内的细胞死亡增加。上皮细胞死亡是胃肠道感染期间宿主的防御机制，还是细菌在宿主体内定植并持续存在的策略，这一问题一直备受争议⁴。在鼠伤寒沙门氏菌的背景下，胃肠道感染伴随上皮细胞死亡，并伴有复杂的潜在信号级联，并与中央细胞死亡通路的几个关键成员的上调有关。这些包括但不限于参与凋亡的Caspase-8和Caspase-3，控制焦亡的Caspase-1和IL-1b表达增加，以及与坏死相关的混合系激酶结构域如假激酶(Mlkl)水平升高。因此，这种复杂的分子网络需要调节机制来协调这些不同的细胞死亡途径，以确保病原体清除和宿主生存。

一种中央细胞死亡调节剂是Caspase-8。先前的研究表明，上皮Caspase-8是通过协调黏膜防御机制来控制细菌负荷和防止组织定植来促进宿主对鼠伤寒沙门氏菌抗性的关键。此外，Caspase-8通过NLRC4炎症小体的激活参与肠细胞排出⁸。新的研究进一步将复杂的细胞死亡信号级联(包括凋亡、焦亡和坏死，因此称为PANoptosis)与胃肠道感染联系起来¹⁰。焦亡，其特征是Caspase-1和/或Caspase-11水平升高以及炎性小体激活，并由Gasdermin D (GSDMD)介导的孔隙形成驱动。同样，坏死是由MLKL寡聚驱动的质膜纳米孔执行的¹¹。我们之前已经证明，Caspase-8对这一过程的负调控(使用Casp8ΔIEC小鼠，肠道上皮中缺乏Caspase-8)在肠道感染中发挥了重要作用⁶。因此，我们发现，这种控制机制的缺乏与Casp8ΔIEC小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后的致命结果有关，这是由于在感染早期上皮细胞过度死亡。在对照组和Casp8ΔIEC小鼠中观察到的感染过程中相同的Mlkl表达水平突出了Caspase-8作为中央细胞死亡调节剂的作用，以防止大规模和有害的坏死。有趣的是，Casp8ΔIEC小鼠的致命性仅部分依赖于TNF6。因此，有研究表明，除TNF外，干扰素(IFNs)可以通过激活STAT1途径触发上皮细胞死亡。在Casp8ΔIEC小鼠感染沙门氏菌期间，干扰素表达增加。

干扰素包括I型、II型和III型，与细胞死亡调节和病原体控制有关。因此，I型干扰素诱导的巨噬细胞坏死与免疫逃逸和细菌扩散相关^14,15,16,17。II型IFN信号通过增强杯状细胞分泌和释放粘液以及Paneth细胞分泌充满抗菌肽的液泡来限制粘膜组织中的病原体载量^18,19。此外，II型IFN通过触发细菌从含沙门氏菌的液泡释放到受感染细胞的胞质中来阻止细菌在肠道内的传播⁵。此外，III型干扰素除了具有细胞固有的抗病毒功能外，还通过稳定上皮屏障完整性来阻止细菌的跨细胞传播，从而显示出宿主保护作用²⁰。

在分子水平上，IFNs通过它们各自的受体Janus激酶(JAK)——信号传感器和转录激活因子(STAT)信号通路触发。根据细胞和疾病背景，复杂的JAK-STAT途径可以诱导多种基因，这些细胞因子在感染过程中可能是朋友或敌人，这并不奇怪^22,23,23。因此，在小鼠和人类的研究表明，STAT1突变的受试者易受病毒和细菌病原体的感染，突出了STAT1在感染过程中的重要作用^{24,25,26,27,28,29}。然而，干扰素- stat1信号级联在细胞死亡调控和维持肠道稳态方面的全部范围尚不完全清楚。

在这里，我们证明了上皮细胞STAT1信号在细菌性肠炎期间通过控制肠上皮细胞的挤压在宿主防御中是必不可少的。在分子水平上，我们发现转录因子STAT1诱导中枢细胞死亡通路的几个关键成员的基因表达，并控制胃肠道感染期间肠上皮中caspase -8依赖和非依赖的细胞死亡的激活。在感染的初始阶段，这对于协调受感染上皮细胞的细胞挤压尤为重要。值得注意的是，STAT1介导的细胞死亡激活似乎是多种病原体(包括细胞内以及附着细菌)的广泛控制机制。总的来说，我们的研究揭示了stat1信号通路在调节上皮细胞死亡中是必不可少的，而在沙门氏菌感染期间，这一信号通路的中断会扰乱黏膜稳态。

结果

STAT1在沙门氏菌引起的肠炎中协调上皮细胞死亡

此前，我们已经证明Caspase-8通过介导上皮细胞凋亡和抑制程序性坏死(坏死)在沙门氏菌感染中发挥关键作用(补充图S1A)6。肠上皮中Caspase-8的缺乏引发了过度坏死，并导致肠屏障的破坏，最终导致全身细菌扩散。大量炎症细胞死亡伴随着促炎细胞因子表达的增强，通过转录调控和细胞死亡调节因子的激活进一步促进细胞死亡(补充图S1A)6。先前的研究表明，炎性上皮细胞的死亡和Caspase-8缺陷(Casp8ΔIEC)小鼠的致命性仅部分依赖于TNF6，这表明其他因素可以触发细胞死亡。事实上，最近包括我们自己在内的研究表明，根据细胞类型和组织，干扰素可以触发野生型和遗传倾向动物的细胞死亡12,13,14,15,17。此外，Casp8ΔIEC小鼠在沙门氏菌感染过程中，几种干扰素的mRNA拷贝数升高，与STAT1磷酸化增强相关(补充图S1B D)6。这些数据强烈表明，IFN-STAT1信号通路与胃肠道感染期间caspase -8依赖和非依赖的细胞死亡之间存在联系(补充图S1)。

在鼠伤寒沙门氏菌感染期间，上皮细胞STAT1对限制组织损伤至关重要

为了进一步研究STAT1在组织损伤反应中的作用，我们分析了感染后10天的小鼠。有趣的是，Casp8ΔIECmice中Stat1缺失的保护作用在整个感染过程中是稳定的。在感染后第10天，Casp8ΔIECxStat1 /小鼠仍然存活，与对照组小鼠相比，体重没有显著变化或显示组织学改变(补充图S2A，B). Tnf作为细胞死亡诱导物和Mlkl作为坏死的关键因子的表达水平在对照组小鼠中显著升高(补充图S2C)。在这两种菌株中，TUNEL和E-Cadherin染色显示完整的上皮屏障，只有轻微的细胞死亡迹象(补充图S3A)，表明缺乏STAT1足以防止坏死。免疫细胞特别是巨噬细胞的招募是感染过程中限制和消除病原体的一种重要的宿主防御机制。在感染过程中，我们可以观察到对照小鼠和双缺陷小鼠之间的粘膜巨噬细胞或中性粒细胞的数量(补充图S3B)或炎症标志物如S100a9和Reg3g的mRNA拷贝数(补充图S2C)的微小差异。综上所述，这些数据表明，STAT1在肠道上皮细胞中发挥关键作用，通过协调鼠伤寒链球菌肠道感染期间的细胞死亡作为宿主反应。

在啮齿柠檬酸杆菌感染期间，STAT1维持组织稳态

研究表明，STAT1参与了细胞内病原体沙门氏菌感染过程中caspase -8独立的程序性坏死，我们对这是否是胃肠道感染中广泛使用的宿主防御机制很感兴趣。为了解决这个问题，我们利用了c.r odenum模型，这是一种模仿人类感染的小鼠病原体，附着并消除大肠杆菌(EHEC/EPEC)。虽然之前的一项研究已经证明IL-22-STAT3信号级联在啮齿动物感染过程中具有重要作用，但STAT1的作用尚未阐明33。为了为STAT1在c.r odenum感染过程中控制caspase -8依赖和非依赖的细胞死亡提供功能证据，我们感染了对照组Casp8ΔIEC小鼠和Casp8ΔIECxStat1 /小鼠。

有趣的是，与沙门氏菌感染时观察到的情况一样，啮齿菌感染导致小鼠肠道上皮中缺乏Caspase-8的致命疾病结局相似(图3)。因此，Casp8ΔIEC小鼠从感染后第5天开始体重显著下降，所有小鼠均在10天内死亡(图3A，C).与沙门氏菌感染类似，大量上皮细胞死亡，伴有大量坏死区域，并伴有严重的组织破坏和上皮完整性丧失(图3B, D)。有趣的是，尽管之前的研究表明，STAT3在柠檬酸杆菌感染中起主要作用，我们的数据表明，STAT1部分参与了细胞外病原体的宿主防御。因此,控制体重,Casp8ΔIEC和Casp8ΔIECxStat1 /老鼠仍然类似的第五天,但在这个时间点Casp8ΔIEC老鼠显示快速减肥和高致死率在9天,而大多数Casp8ΔIECxStat1 /老鼠仍然活着只有轻微的减肥(图3)。在第7天，当我们对小鼠进行详细分析时，Casp8ΔIECxStat1 / mice仍然显示出适度的体重减轻(图3C)。此外，在组织学水平上，Casp8ΔIEC小鼠中，C. rodentium感染相关的细胞死亡和屏障功能障碍很明显，隐窝绒毛结构的显著损失，大量浸润的免疫细胞和大量细胞死亡。与此形成鲜明对比的是，对照组和Casp8ΔIECxStat1 /小鼠表现出先前发表的增生34，细胞死亡和屏障完整性水平相当(图3B)。Caspase-8上游STAT1和坏死在啮齿动物感染背景下的中心作用在肠组织改变的组织学评分和定量中得到进一步支持(图3D, E)。有趣的是，在Casp8ΔIEC小鼠和Casp8ΔIECxStat1 /动物之间，我们没有观察到Mlkl mRNA表达的差异(图3F)。

STAT在胃肠道感染期间的激活

STAT3主要介导上皮细胞恢复和组织再生35，而STAT1被描述为细胞死亡的调节剂12,13。为了更好地描述IFN-STAT1和IL-22-STAT3轴在胃肠道感染中的作用，我们比较了两种不同感染模型中STATs的磷酸化。STAT3在高水平激活两种类型的感染沿整个crypt-villus轴,显示在广泛的磷酸化STAT3信号(pSTAT3 Tyr705)在免疫组织化学染色(无花果。4 a, B)和量化的STAT3磷酸化蛋白质印迹(pSTAT3 Tyr705图4 c,pSTAT3在Ser727(补充图S4)。相比之下，STAT1通过Tyr701位点的磷酸化激活局限于特定区域，在表面上皮的上皮细胞中最突出，该细胞暴露于包括侵入和附着病原体在内的管腔内容物(图4B)。在入侵病原体(S.鼠伤寒)的情况下，在表面上皮细胞和隐窝深处的上皮细胞中可检测到磷酸化的STAT1(图4A)。与此形成鲜明对比的是，在柠檬酸杆菌感染期间，STAT1的激活仅限于隐窝区域内的高度定义区域。Western Blot分析证实，在沙门氏菌诱导的肠炎中，与来自啮齿菌感染和稳态条件下的组织相比，STAT1 Tyr701磷酸化水平增加(图4C，补充图S4)。总之，这些结果表明，STAT1信号在两种感染中都被激活，在绒毛上皮中最突出，表明STAT1信号通过控制上皮细胞死亡参与了细菌感染过程中的细胞挤压。而STAT3在STAT1介导的细胞丢失后的组织损伤反应中具有重要作用。

在沙门氏菌感染期间，STAT1转录控制肠道上皮中的中央细胞死亡途径

为了确定上皮细胞STAT1信号是否通过协调上皮细胞死亡(特别是作为早期防御)参与宿主对鼠伤寒链球菌的应答，我们感染了肠道上皮中特别缺乏STAT1的小鼠(Stat1ΔIEC)。与对照组小鼠相似，Stat1ΔIEC小鼠在口腔感染野生型鼠伤寒沙门氏菌后体重下降(图5A)。虽然我们无法观察到体重下降的差异，但我们发现Stat1ΔIEC小鼠的粪便中细菌负荷升高，特别是在感染后第一天(图5B)。在观察屏障功能和细胞脱落时，我们观察到，在盲肠和结肠中，上皮细胞STAT1的缺乏显著减少了上皮细胞的挤出(图5D, E)。然而，包括水肿在内的粘膜下层的病理生理改变等特征在缺陷小鼠和对照组小鼠之间是相似的(图5C, D)。因此，我们无法观察到在感染的早期时间点入侵的免疫细胞数量的变化(补充图S5A)。然而，在Stat1ΔIEC小鼠中，与屏障完整性增强一致的是，管腔和上皮中TUNEL阳性细胞的数量显著减少。E- cadherin染色显示，对照组小鼠上皮屏障减弱，粘附连接脆弱，而缺陷小鼠上皮内壁完整(图5D, E)。有趣的是，两组间TNF血清水平相当(补充图S5B)。证明细胞死亡频率不是由细胞死亡激活物减少引起的。为了进一步描述STAT1对上皮细胞挤压的影响，我们评估了一系列中央细胞死亡通路关键成员的mRNA表达。有趣的是，我们观察到转录因子STAT1的缺失影响了多个细胞死亡途径的基因表达(图6A)。因此，在Stat1ΔIECmice中，与鼠伤寒链球菌感染相关的三个最显著的细胞死亡途径——凋亡、坏死和焦亡——的中心分子的基因转录均显著降低。外源凋亡的关键caspase包括启动子caspase -8和效应子caspase -3，以及参与焦亡的caspase -1和caspase -11均显著下调。此外，Western Blot分析显示，STAT1缺陷小鼠的中央细胞死亡调节因子Caspase-8的激活显著降低。重要的是，我们不仅观察到p18亚基(完全激活的形式)的减少，而且还观察到部分激活的形式(p43)的急剧减少，这对阻止坏死很重要(图6C)。此外，Mlkl和Zbp1(最近被描述为necroptosis11的上游调控因子)的基因转录严重受损。与此形成鲜明对比的是，作为细胞凋亡和坏死的关键开关的Ripk1表达不受STAT1缺失的影响。此外，参与Caspase-1和Caspase-11下游自燃过程的炎性小体成员(Naip6, Nlrp3)和相关分子(Gsdmc, Gsdmd)未发生改变(图6A)。我们进一步观察到，在肠上皮中缺乏STAT1的小鼠中，NF-κB靶基因iNos显著降低(图6A)，这表明STAT1在该信号通路上游的作用有待进一步评估36。此外，由于消除感染细胞是宿主防御入侵病原体的关键，Stat1ΔIECmice显示促炎标志物S100a9和IL-22血清水平升高，抗菌肽Reg3g转录增强(图6A, B)。

结论

综上所述，我们的研究揭示了干扰素和STAT1信号通路通过调节复杂的细胞死亡网络在宿主早期防御细菌病原体中发挥了关键作用。由于缺乏中央调控因子，这一网络的失调可能导致支持炎症和细菌扩散的大量细胞死亡，或者阻止细胞死亡，减少细菌消除。因此，我们提出STAT1在多种细胞死亡机制的汇聚点起作用，这对宿主的生存和细菌的生长是必不可少的。