文献分享:WRKY71是怎样调控叶片衰老的?来,一起学习下研究方法和思路!

发布于 2021-10-18 14:34

拟南芥WRKY71通过直接激活EIN2, ORE1ACS2基因来调控乙烯介导的叶片衰老

ØA series of reports have indicated the involvement of the WRKY transcription factors in regulating leaf senescence, but the molecular mechanisms and signaling pathways remain largely unclear. 虽然说WRKY在调控叶片衰老中的作用已有报道,但是其分子机制以及信号途径仍不清楚。(很多文献中都有这样的句式,自己写作时也可以套用)

Ø研究者通过试验表明,WRKY71在拟南芥叶片衰老中起正调控作用。过表达WRKY71基因的株系WRKY71-1D表现出早期叶片衰老,而WRKY71功能缺失的突变体株系wrky71-1表现出叶片衰老延迟的现象。

Ø免疫共沉淀试验表明,WRKY71能够直接结合到SAG13SAG201基因的启动子上。

Ø转录组分析表明,WRKY71可能介导了非生物胁迫、黑暗和乙烯等多种加速叶片衰老的途径。WRKY71是由乙烯诱导表达的,经乙烯前体1-氨基-环丙烷-1-羧酸后加速了WRKY71-1D的叶片衰老,但是在WRKY71-1株系中只引起了叶片边缘部位的衰老延迟。

Ø试验验证,WRKY71可直接调控EIN2, ORE1also named ANAC092 or NAC2)。Consistently, leaf senescence of WRKY71-1D was obviously retarded in the ein2-5 and nac2-1 mutants. 分别以ein2-5 nac2-1为背景创制的过表达材料与以WT为背景创制的过表达材料相比,明显表现出叶片衰老延缓的现象。(虽然表述有些绕,但是还是比较好理解的)。除此之外,WRKY71还可与ACS2基因相互作用。

Ø一句话总结:In conclusion, our data revealed that WRKY71 mediates ethylene signaling and synthesis to hasten leaf senescence in Arabidopsis.

u叶片衰老是植物维持生命活动的关键过程;

u内因和外因构成了一个复杂的调控网络影响叶片的衰老,其中植物激素乙烯促进了叶片的衰老;

u乙烯不能直接触发叶片衰老的发生,而是在其下游乙烯响应因子之间起到中介作用

uWRKY家族成员在生物、非生物胁迫以及拟南芥生长发育中起到很重要的作用,部分成员也参与到了叶片衰老进程中,有的还是通过参与植物激素介导的叶片衰老进程中。但是(虽迟必到),Unfortunately, the regulatory relationship between the WRKY proteins and ethylene signaling in leaf senescence is less well understood.

uIn the present study, through molecular genetics and biochemical approaches, we found that WRKY71 is able to directly upregulate the ethylene signaling pathway genes EIN2 and ORE1 and promote ethylene synthesis by directly activating ACS2 to accelerate leaf senescence in Arabidopsis.

结果一(基础):Alteration of WRKY71 expression levels influences leaf senescence (WRKY71功能鉴定,表型基础)

通过WRKY71的过表达和突变体株系表明WRKY71影响了叶片的衰老;通过对比莲座叶的黄叶数量多少,从b图明显看出过表达株系最多,WT次之,突变体最少;测定叶绿素含量变化情况,从c图明显看出过表达株系最快,WT次之,突变体最慢;分析光系统II的光化学效率(the photochemical efficiency of photosystem II (PSII) (Fv/Fm)),从d图明显看出过表达株系光化学效率最低,而突变体株系最高;除此之外ion leakage rate保持类似的趋势;另外研究者构建了功能互补株系,WRKY71可恢复wrky71-1的表型。

这些结果回答了一个问题:WRKY71有什么功能?结果表明WRKY71参与了叶片的衰老过程。

结果二(基础):Transcription profiles indicate that WRKY71 plays a crucial role in the regulation of senescence-associated genes

To confirm the involvement of WRKY71 in leaf senescence, we examined the expression profiles of WRKY71. 通过表达谱进一步证明WRKY71确实参与了叶片衰老的过程。研究者做了叶片衰老相关的基因,以及WRKY71在一个叶片的不同部位和不同叶片中的表达量,集中得出了WRKY71在调控叶片衰老相关基因中发挥作用。(和结果一一样,是一个基础工作,每个人都可以做到这一步

结果三(升华):WRKY71 promotes leaf senescence by directly activating the expression of SAG13 and SAG201 (开始涉及一些机理的东西了,这也是我们工作需要升华的地方)

As the leaf senescence marker genes SAG13 and SAG201 were upregulated by WRKY71 they were probably the targets of WRKY71, so we analyzed their promoters and found that 15 and four W-boxes are present in the promoters of SAG13 and SAG201, respectively (Figure 3a). 自我感觉这下游靶基因找的有点随意,但确实也是研究的一种方法——推测,然后去验证推测。这个需要一定的文献积累和敏锐的观察力。然后通过LUC试验证实SAG13 SAG201是WRKY71的靶基因。通过WRKY71-DSAG13SAG201的突变体杂交后表型以及各种生理数据表明,WRKY71通过直接调控SAG13SAG201进而加速了叶片的衰老。(到此还不足以发一篇PJ,所以需要再次升华!!)

结果四(基础):Transcriptome analysis suggests that WRKY71 influences leaf senescence via multiple pathways 该怎么升华确实是个难题,但是材料是全的,所以测个转录组看看是不是有好玩的东西,研究者也想构建一个调控网络)

Col-0, WRKY71-1D and wrky71-1 were used for RNA sequencing analysis. To verify the transcriptome analysis, we examined the transcript levels of the genes by RT-qPCR using the 5-weekold leaves of Col-0, WRKY71-1D and wrky71-1. 做个定量验证一下转录组的可靠性。

结果五(基础):WRKY71 responds to ethylene in leaf senescence

这部分和结果四应该是一起的。通过转录组得到一些结果,然后研究者将研究的重点放在了乙烯介导的叶片衰老的途径中。通过乙烯利(ACC)处理,WRKY71转录水平提高,各株系叶片出现差异、相关生理指标出现异同,These results demonstrate that WRKY71 is able to mediate ethylene to promote leaf senescence通过这些试验,终于把WRKY71和乙烯途径结合到一起了。

结果六(基础):WRKY71 mediates ethylene signaling to accelerate leaf senescence (这一结果就是给结果五提供新的依据,也为下一个结果做铺垫,可以称之为承上启下)

WRKY71-1D株系中检测乙烯相关基因的表达,确实是有差异的,为结果五又提供了重要的依据。除此之外,通过杂交又进一步证实了这一结果。通过文章可了解到,研究者有一些和乙烯相关的突变体ein2-5, ein3-1eil1-1 and nac2-1以及和叶衰老胁迫相关的突变体,有需要的可以尝试联系。These results indicate that WRKY71 is able to mediate ethylene signaling to accelerate leaf senescence.

结果七(升华):WRKY71 binds to the promoters of EIN2 and ORE1 in vitro and in vivo

Sequence analysis indicated that EIN2 and ORE1 harbor six W-boxes in their promoters (Figure 7a), suggesting that they are probably the downstream target genes of WRKY71.先预测了WRKY71的靶基因。通过EMSA试验证明了,WRKY71 can bind directly to the promoters of EIN2 and ORE1。此外,又通过ChIP和LUC试验证实了这一结果。These data demonstrate that EIN2 and ORE1 are the targets of WRKY71

结果八(升华):WRKY71 directly activates expression of the ethylene synthesis gene ACS2

通过对转录组的挖掘,发现ACS2也可能受WRKY71的调控。通过EMSA、ChIP和LUC试验表明,WRKY71 can directly activate ACS2, implying its function in ethylene synthesis.

结果九(升华):WRKY71 promotes leaf senescence via the activation of ethylene synthesis (最后的总结与升华)

研究者本想检测乙烯含量,但是乙烯含量低到无法检测,因此采用乙烯合成抑制剂的方式(敲黑板,inhibitors of ethylene synthesis, AgNO3 and aminoethoxyvinylglycine (AVG))。通过抑制乙烯的合成,也延缓了WRKY71所导致的叶片衰老,因此得出结果为,the arrest of ethylene synthesis can retard WRKY71-accelerated leaf senescence. 再次通过杂交试验证实了,WRKY71 can directly activate ACS2, thereby promoting the synthesis of ethylene to accelerate leaf senescence.

本文着重分析研究的思路,即本研究是怎样的一步步推进的,至于讨论需要感兴趣者深入阅读。其中,由于个人码字,不乏表达或见解错误之处,欢迎拍砖给予纠正!!同时欢迎大家投稿,和广大植物科研人员(特别是刚进入科研领域的小白)一起分享交流,稿件接收邮箱2319938641@qq.com!!

Pivotal step 关键步骤

senescence-associated genes (SAGs) 衰老相关基因

Chromatin immunoprecipitation assays (ChIP)染色质免疫共沉淀试验

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