文献解读 | 单细胞技术同时检测DNA和表面蛋白,表征血液肿瘤基因型和表型的动态变化

DAb-seq 从使用抗体-寡核苷酸偶联物的混合物对细胞悬浮液进行免疫染色开始（图1a）。每个抗体都与一个已知的寡核苷酸标签相关联；因此，当细胞被标记的抗体染色时，每个细胞都会结合抗体及其标签。染色的细胞通过Tapestri仪器上的一系列微流体设备进行处理。工作流程遵循两步方案来裂解细胞和消化染色质，使基因组可用于扩增；然后对液滴进行多重PCR以同时扩增目标基因组并捕获抗体标签，用来自同一细胞的相关序列的条形码片段标记两者（图1b，c）。该测序会产生一个多组学数据集，包含每个细胞的基因型和免疫表型。将数据降维可视化并进行无监督聚类后，可以定义具有相似免疫表型的细胞群（图1d）。

图1 DAb-seq 工作流程

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作者使用 PBMC样本评估了DAb-seq用于绘制造血免疫表型的有效性。当应用来自健康供体的PBMC时，该方法获得了预期的细胞亚群（图2a、b）。为了进一步验证DAb-seq的基因分型能力，作者使用了来自不同造血谱系（Jurkat、Raji、K562）的三种细胞系的混合物，观察到单细胞基因型和表型之间的预期一致性（图2c、d），且DAb-seq的基因分型足够敏感，可以根据给定突变的接合度区分细胞（图2d）。这些结果表明，DAb-seq可以同时分析来自基因组 DNA 靶向扩增的细胞基因型和来自条形码抗体的免疫表型。

图2 DAb-seq可用于评估PBMC的免疫表型和基因型

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当所有恶性细胞中均质表达靶标标志物时，针对细胞表面蛋白的AML疗法才会比较有效。因此，作者假设突变细胞应该与对这种治疗有反应的患者的共同靶向表型密切相关。为了研究这一点，作者对来自接受Gemtuzumab（一种CD33靶向疗法）的AML患者的骨髓抽吸物的21,952个细胞进行了DAb-seq，跨越四个治疗时间点（图3a）。从单细胞DNA基因分型数据确定了NPM1基因突变（NPM1^mut ) 跨越复发、缓解和进展等多个时间点。此外，NPM1突变与DNMT3A基因座的突变共同发生（图3a）。与预期一致，被Gemtuzumab靶向的CD33⁺细胞在缓解时间点消失。为了检查NPM1^mut细胞群的免疫表型谱，作者绘制了单细胞CD33和CD34值与NPM1跨时间点的突变状态变化图（图3b）。如图所示，在治疗过程中，CD34^-类群中NPM1^mut细胞的比例与CD34⁺类群相比没有很大差异，而药物靶向的CD33⁺细胞在缓解时不存在，与治疗反应一致。对所有时间点的分析表明，细胞基因型与相应表型之间存在对应关系。为了进一步探索基因型和表型之间的这种关系，作者将高维单细胞免疫表型降维可视化为UMAP图（图3c）。单个免疫表型亚群内的细胞来自不同的时间点，突出了正常和恶性免疫表型随时间的稳定性。当叠加NPM1基因型到免疫表型的UMAP空间时，作者发现由具有NPM1突变状态的CD33⁺细胞组成的单个恶性免疫表型与该群体中CD34、CD38和CD117的可变表达之间存在明显关联（图 3d）。这与此前使用流式细胞术研究观察到的结果一致。上述结果表明，在该患者中DAb-seq可证实Gemtuzumab治疗消除了CD33⁺细胞，并揭示了跨时间点基因型和表型之间的强烈对应关系。

图3 AML母细胞在治疗中表现出稳定的基因型和表型

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为了研究上述确定的基因型-表型紧密关联是否是 AML 的普遍特征，作者将DAb-seq应用于接受化疗但最终复发的儿科患者。基因型上，作者鉴定出了两个相互排斥的KRAS和FLT3突变克隆。发现FLT3^mut类群最初比例很低但在复发时占主导地位，而KRAS^mut类群最初比例较高，复发时已消失（图4a）。在免疫表型上，作者还鉴定了包含KRAS^WT / FLT3^WT细胞的第三子集，这些细胞表达了一种类似母细胞的CD33⁺ CD38⁺免疫表型，在目标基因座中没有可识别的DNA突变。当按基因型对所有时间点的细胞进行分组时，致病母细胞显示出可变的免疫表型，两者之间没有明确的映射（图4b）。在此样本缺乏明显的基因型-表型映射的情况下，作者通过进一步分析探索了他们之间的潜在关系。使用UMAP，作者将抗体数据投影到二维中，根据基因型对点进行着色（图4c），可观察到基因型之间不完全分离的单个免疫表型亚群。为了估计母细胞亚群连续体中的抗体谱表达，作者确定了表型空间中的主要梯度，并沿着梯度对所有细胞进行排序。然后计算邻近细胞的局部平均抗体和基因型组成（图4c、d）。与预期一致，一些标志物与主要免疫表型梯度抗相关（CD11b、CD33 和CD56）或相关基因型组成沿梯度显着变化，KRAS^mut克隆频率反相关且FLT3^mut相关（图4d）。

图4 一名儿科AML患者的不同遗传亚克隆形成重叠的免疫表型连续体

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最后，作者分析了一名接受gilteritinib治疗的患者。这种FLT3抑制剂疗法可促进髓系母细胞的体内分化。这种处理被认为会将细胞分散为不同的基因型和多种免疫表型。作者通过对该病例的分析，确定了DAb-seq可区分出分散的免疫表型，并确认其终末造血谱系。具体地，作者分析了四个时间点的 18,287个细胞，从诊断开始，发现了一个具有DNMT3A和NPM1共突变的亚克隆（图5a）。在cytarabine/daunorubicin诱导治疗后，一部分DNMT3A^mut细胞仍处于缓解状态。在复发和用FLT3抑制剂 gilteritinib 治疗后，除了最初的DNMT3A和NPM1外，大多数细胞还含有FLT3 ITD突变。从单细胞数据推断的基因型结构揭示了响应治疗的顺序获得突变的线性、分支层次结构。为了探索该患者疾病的免疫表型特征，作者整合了来自所有时间点的细胞并使用抗体数据构建 了UMAP图（图5b）。作者使用造血谱系的表型标记物来手动注释抗体数据（图5c），确定了三个表达高水平CD33和CD38的母细胞群，一个表达CD15和CD16的单核细胞群，以及CD71和CD3升高的红细胞和淋巴细胞亚群。与预期一致，跨治疗时间点的样本包含免疫表型正常和母细胞样细胞的混合物。为了表征突变细胞和正常细胞在免疫表型亚群中如何分布，作者在每个时间点都根据 DNA 基因型标记 UMAP 空间中的细胞并生成CD33信号的密度分布（图5d）。作者还评估了每个时间点表型亚群成员的计数，按DNA 基因型细分。DAb-seq阐明了这一过程的丰富动态，并说明了不同的DNA基因型如何可以根据治疗分成多种表型。

图5 响应 FLT3 抑制剂治疗的母细胞表型和基因型的分离

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本研究使用单细胞DNA+表面蛋白测序技术阐明了急性髓系白血病发病和治疗过程中下细胞基因型和表型的动态变化进行了详细表征，并说明不同的基因型如何可以根据治疗分成多种表型。这些数据和结论，为进一步研究耐药性并开发新的抗病药物提供了参考。

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