【文献解读】Planta:光诱导葡萄花青素合成的B-box蛋白和VvBBX44的全基因组鉴定

发布于 2021-09-27 19:18

文献解读  320

光诱导葡萄花青素合成的B-box蛋白和VvBBX44的全基因组鉴定
期刊： Planta（3.390）
发表时间：2021.05
研究背景

B-box(BBX)蛋白是一类具有一个或两个BBX结构域的锌指转录因子或调控因子，在植物生长发育中起着重要作用。然而，BBX基因的潜在功能在葡萄中尚未得到充分的研究。本研究在葡萄基因组中广泛识别了25个BBX家族基因包括一个新成员(命名为VvBBX44)。分析了这些VvBBXs在赤霞珠的茎、花、叶、卷须、叶柄和发育中的浆果中的表达水平。VvBBX44的表达在“赤霞珠”浆果发育过程中增加。在没有阳光照射的情况下，“京秀”和“赤霞珠”中VvBBX44的表达受到抑制。此外，VvBBX44过表达降低了葡萄胚轴长和葡萄糖类黄酮3-醇-葡萄糖基转移酶(VvUFGT)的表达，降低了葡萄愈伤组织中花青素的含量，提示VvBBX44可能通过直接抑制VvHY5的表达而在葡萄果实着色中发挥重要作用。该研究为VvBBXs在浆果发育和光反应中的潜在作用提供了新的见解，并有助于了解VvBBX44在花青素生物合成中的调控机制。


结果

1. 葡萄BBX图谱
在葡萄基因组中鉴定了25个BBX ZfP。所有VvBBXs都有一个或两个保守的BBX结构域(表 S1)，VvBBX蛋白的理化性质见表S2。
为了探讨VvBBXs的进化关系和功能分化，从全长氨基酸序列中构建了一个包含25个VvBBXs、32个AtBBXs和30个OsBBXs的系统发生树（图 1）。这三个种的BBX基因分布于五个亚科。VvBBXs与AtBBXs的关系比与OsBBXs的关系更为密切，因为葡萄和拟南芥都是双子叶植物。第一组、第二组、第三组、第四组和第五组分别含有三个、七个、一个、七个和七个VvBBX成员。
功能域分析表明VvBBX蛋白中共有3个保守结构域(即BBX1、BBX2和CCT)。属于I、II组的VvBBXs具有BBX1、BBX2和CCT结构域。第三组中只有一个成员，即VvBBX42，含有一个与CCT结构域相一致的BBX结构域。在I组和II组VvBBXs中，CCT结构域与每个蛋白上的两个BBX结构域相一致。IV组和V组成员的基因体中没有CCT结构域。IV组有4个成员，每个成员有2个BBX结构域。在V组中，只有VvBBX27包含BBX1和BBX2结构域，其他成员只包含一个BBX结构域(图 S2及表 S1)。BBX1(C-X2-C-X7-8-C-X2-D-X4-C-X2-C-D-X3-H-X8-H)和BBX2(C-X2-C-X8-C-X1-2-D-X4-5-C-X2-C-X10-13-H)的锌结构域与VvBBXs氨基酸序列中的5个保守Cys结构域相似(图 2a，b)。VvBBX蛋白的CCT结构域也是高度保守的(图2c)。

2. VvBBX基因的染色体位置和结构
单核、双核、三核和四核VvBBX分别位于12条染色体上(单核: 5,7,9,11; 双核: 3,4,14,18; 三核: 1,19; 四核: 12)。VvBBXs 的染色体定位是随机的，没有任何分布规律。在基因进化过程中，基因重复事件对于产生新的家族成员很重要。通过节段和串联重复的共线分析，探讨VvBBX基因家族的进化机制。结果表明，VvBBX21a、VvBBX21b、VvBBX27、VvBBX33、VvBBX34、VvBBX36、VvBBX38、VvBBX39、VvBBX40、VvBBX41、VvBBX43、VvBBX44、VvBBX45、VvBBX46、VvBBX49、VvBBX51等17种VvBBX36参与了节段性复制事件。VvBBX39和VvBBX47参与串联重复事件(图 S3)。这些节段性重复事件占VvBBX基因扩增的89.47%。
在VvBBXs中，外显子和内含子是不同的。VvBBX32、VvBBX43、VvBBX44和VvBBX47分别只包含一个外显子(图 S2)。根据功能分析，MEME结果显示三个VvBBXs保守序列(图2d)，分别属于BBX1、BBX2和CCT结构域。BBX结构域和CCT结构域的长度分别约为40和43个氨基酸残基(图2d)。
在25个VvBBX基因的启动子区域分别鉴定了九十种顺式元件。VvBBX启动子区常见的顺式元件为CAAT-box、TATA-box、G-box（表 1）。从17个VvBBX中鉴定了十七个VvBBX特异性元件。特别是VvBBX27、VvBBX36、VvBBX39和VvBBX50具有另一个光响应元素。

3. VvBBXs在浆果三个主要发育阶段和葡萄其他器官中的表达情况
通过定量RT-PCR方法，检测了3个主要发育阶段“赤霞珠”浆果中VvBBXs的相对表达水平：EL33，浆果仍然坚硬和绿色；EL35，浆果开始变色和变大；EL37，浆果仍然不完全成熟。VvBBX27、VvBB43、VvBB44、VvBB46、VvBB47、VvBB50等6个基因的表达水平在整个发育过程中呈上升趋势，VvBBX32的表达水平则呈下降趋势(图3)。VvBB32、VvBB43、VvBB44和VvBB47基因的表达模式与转录组学数据(SRA055265)在果实成熟后期、中熟期和中熟期的表达模式相一致。利用定量RT-PCR技术检测了VvBBX基因在葡萄茎、叶、叶、卷须、叶柄等赤霞珠器官中的表达。大多数VvBBX在叶片中高度表达。VvBBX47不表达，VvBBX35、VvBBX51、VvBBX22和VvBBX48在叶片中的表达水平低于其他 VvBBX8成员。而VvBBX45和这4个叶片表达水平较低的基因在花粉中高表达。VvBBX47、VvBBX35、VvBBX51、VvBBX22、VvBBX48、VvBBX33和VvBBX34在叶柄中均有高表达。大多数VvBBX在茎和卷须中表达较低。图3显示VvBBXs的表达模式可以分为四类：第一类是VvBBX45、VvBBX46、VvBBX32和VvBBX33，它们在叶片或花叶中高度表达；第二类是13个成员，它们在果实的EL33期高度表达；第三类是VvBBX22、VvBBX47和VvBBX51，它们在花叶中高度表达；第四类是在EL37期高度表达的5个成员。

4. 葡萄果实中VvBBXs的表达及其对避光的响应
在以前的研究中，用正常光照条件下生长的果穗作为对照，在结果期对京秀浆果进行避光处理，以确定光照对葡萄浆果皮基因表达的影响。结果表明，“京秀”在浆果皮花青素的生物合成中对光具有依赖性。避光处理条件下，VvBBX11、VvBBX21a、VvBBX21b、VvBBX22、VvBBX32、VvBBX34、VvBBX35、VvBBX36、VvBBX37、VvBBX42、VvBBX43、VvBBX44、VvBBX45、VvBBX46、VvBBX48均受到下调，VvBBX40和VvBBX41则受到上调。避光处理后，京秀中VvBBX44明显下调(图 S4b)。这些结果表明VvBBX44的表达与花青素的生物合成有关，并与光照条件有关。
本研究通过测定京秀和玫瑰香葡萄浆果中9个VvBBX的表达水平，进一步探讨VvBBX对光照的反应。京秀和玫瑰香葡萄没有光很难合成花色苷(图4a)。结果表明，在轻度避光条件下，VvBBX36、VvBBX43、VvBBX44和VvBBX50在京秀和玫瑰香浆果皮中均显著下调(p < 0.05 图 S4c)。研究表明，VvBBX44和VvUFGT在浆果皮中的共表达为0.97。总之，我们预测VvBBX44参与花青素的生物合成是依赖于光。这个基因被选为进一步研究的候选基因。

5. 过表达VvBBX44在转录和蛋白水平上抑制VvHY5和VvUFGT葡萄愈伤组织的表达及花青素含量
为了研究VvBBX44在调控葡萄花青素合成中的作用，将VvBBX44转入为“京秀”叶片。如图S6a所示、野生型(WT)和空载体(EV)VvBBX44在光照条件下的表达显著高于黑暗条件下(p < 0.05)。在光照条件下，VvBBX44的过表达导致VvHY5和VvUFGT的表达显著降低(p < 0.05)。为了进一步验证这一结果，以过量表达VvBBX44的霞多丽(Chardonnay)为材料，获得了转基因胚性愈伤组织。VvBBX44在转基因愈伤组织中的表达量分别是EV和WT的464.79和332.20倍。VvHY5在OE-VvBBX44愈伤组织中的表达也明显受到抑制(p < 0.05) 。vBBX44在山葡萄愈伤组织中过量表达，可以合成花色苷，进一步证实VvBBX44对花色苷合成的影响。图5a，b显示了成功过度表达的VvBBX44愈伤组织。光照处理7天后，过量表达VvBBX44的愈伤组织颜色变淡。黑暗处理7天后，过量表达VvBBX44的愈伤组织与EV相比无明显颜色变化。然后用高效液相色谱法测定花青素含量。结果表明，在光照条件下，过量表达VvBBX44的愈伤组织花青素含量低于EV。黑暗条件下，OE-VvBBX44和EV愈伤组织的花青素含量无明显差异。另外，VvBBX44高表达的愈伤组织VvHY5的转录水平和蛋白水平均低于EV。VvUFGT在VvBBX44过表达的愈伤组织中的表达低于EV(图5d)。

6. VvBBX44直接抑制VvHY5的表达
HY5是众所周知的花青素生物合成和积累的上游调控因子。BBXs可能与G-box顺式元件结合以调节其下游基因的表达。在这项工作中，在VvHY5启动子中发现了两个G-box顺式元件(图6a)。用Y1H和DLR检测VvBBX44是否能直接调节VvHY5的表达。Y1H结果表明VvBBX44能与pHY5、pHY5-a和pHY5-b结合(图6b)。在DLR中，VvBBX44抑制VvHY5、pHY5-A和pHY5-B的活性(图6c)。因此，VvBBX44通过调节花青素的合成直接抑制VvHY5的表达是一种可行的方法。


讨论


本文报道了VvBBX的一个新成员(VvBBX44)。然而，在之前的一项研究中，他们没有识别VvBBX中的24个成员葡萄中的基因家族。葡萄中VvBBX的数量低于其他植物如葡萄中VvBBX的数量。水稻(32)、水稻(30)、番茄(29)、马铃薯(30)、梨(37)、苹果(37)，但高于草莓(21)。系统发育分析表明，葡萄VvBBX可分为5个类群，具有BBX1、BBX2和CCT保守结构域，与其他种类相似。鉴于大多数藻类只有一个BBX结构域，VvBBX基因最初被认为只有一个BBX1结构域(第V组)，第二个结构域经过复制后进化(第IV组)。复制在BBX蛋白中产生了一个额外的具有双BBX结构的CCT结构域(I和II组)。在第二组中，BBX1和BBX2基序出现在VvBBX38中，而BBX1和伪BBX2基于多重序列比对基础出现在VvBBX39中。BBX2和伪BBX2之间只有一个氨基酸突变。因此，第三组的BBX1和CCT结构域是通过氨基酸突变产生的(图 S2)。
VvBBX蛋白的基序分析结果与结构域分析结果一致。VvBBX基因的基因结构(UTR、内含子和外显子)的分布没有清晰的模式(图 S2)。这里，在所有VvBBX启动子区域都预测到一系列顺式作用元件(表1)，其中有四个参与了所有这些VvBBX启动子，还有一些轻反应元件。这一结果与之前的研究相似，表明BBX基因参与了光形态建成。在VvBBX启动子区发现一个或多个G-box。VvBBX蛋白可能通过与VvBBX基因启动子区的G-box结合而相互调节。此外，HY5和HYH还与许多基因的E/G-box区的顺式元件结合，VvHY5/HYH蛋白可能通过与启动子区的G-box结合而被VvBBX基因调控。BBX21的第二BBX可以直接绑定到HY5启动子中的T/G-box。在这项工作中，从17个VvBBX基因启动子区域中鉴定了17个VvBBX特异性元件(表1)。特殊元件表明不同的VvBBX基因可能具有不同的功能。在VvBBX基因启动子区，还预测了与几种激素、生物/非生物胁迫和生长相关过程有关的顺式元件。提示VvBBX的表达可能与多种信号通路有关。
植物BBX基因在生长、发育和胁迫反应的一系列生理过程中起着重要作用。因此，对BBX基因在葡萄果实发育中的作用进行了研究。结果表明，VvBBX43和VvBBX44基因的表达水平在果实发育过程中逐渐升高，而VvBBX43和VvBBX44基因的表达水平在果实发育过程中逐渐降低。在赤霞珠浆果中也获得了类似的结果。巨峰葡萄花色苷含量一直通过EL-33提高到EL-37。因此，这些VvBBX基因可能调节葡萄的发育，并与花青素积累有关。VvHY5的表达在巨峰葡萄果实花青素快速积累期达到高峰。在这项研究中，VvBBX44和VvBBX43的表达模式与VvHY5在酿酒葡萄科维纳和赤霞珠浆果发育过程中的表达模式基本一致。结果表明VvBBX44和VvBBX43与果实发育有关。
光是调节浆果花青素积累的关键刺激因子，几个BBX基因与光调节有关。拟南芥AtBBX21和AtBBX22调节光介导的发育。本文研究了葡萄果实的避光处理效果。15个VvBBX包括VvBBX44在“京秀”中的表达水平在避光下下降。而VvBBX40和VvBBX41表现为上调。根据定量RT-PCR结果，在光照条件下，“京秀”和“玫瑰香”果皮中VvBBX36、VvBBX43、VvBBX44、VvBBX47和VvBBX50的表达较光照条件下上调(图4b)。因此，上述VvBBX可能会对光作出反应。
BBX蛋白参与了HY5的正负调控之间的平衡，以促进植物对光环境变化的适应。研究报道了BBX21，一个双B-box结构域蛋白，可以在HY5启动子中与T/G-box结合，从而激活其表达并介导幼苗光形态建成。AtBBX28是一种B-box结构域蛋白，通过参与HY5介导的发育转换，抑制HY5的转录激活活性，并抑制光形态建成。系统发育分析表明VvBBX与拟南芥VvBBX基因的AtBBX28和 AtBBX29关系最密切，只有一个B-box结构域。然而，我们的结果表明VvBBX44可以结合VvHY5启动子中的T/G-box并抑制其转录，AtBBX28不能抑制HY5转录。
HY5通过直接诱导CHS和MYB转录因子基因的表达来调节花青素的生物合成。过表达VvBBX44抑制山葡萄愈伤组织VvHY5和VvUFGT的表达，降低花青素的生物合成(图5)。另外，VvBBX44在光照条件下抑制VvHY5的蛋白水平。因此，VvBBX44可能通过抑制VvHY5的表达来抑制花青素的生物合成，从而直接或间接地抑制VvUFGT的表达。另外，VvBBX44在白葡萄品种霞多丽和京秀叶片的愈伤组织中高表达。结果表明，VvBBX44过表达也可抑制VvHY5。
总之，我们从葡萄中鉴定了25个 BBX 基因，并根据系统发育关系将其分为5个类群。VvBBX44的表达水平与葡萄果实发育过程中花青素浓度有关。其表达受到阳光排斥的抑制。我们进一步的研究结果表明，VBBX44可以抑制 VvHY5和 VvUFGT 的表达，从而抑制花青素的生物合成。因此，VvBBX44可作为光诱导葡萄果实着色的负面因子。


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