怎样鉴定遗传缺陷性疾病的致病基因

随着新一代测序技术的快速发展，低成本、高通量、快速的测序技术使得对遗传缺陷的患者进行全基因组或全外显子组的研究成为可能。今天小编分享一篇全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）在遗传缺陷疾病检测方面的例子。

无头精子症(Acephalic spermatozoa syndrome)属于遗传缺陷性疾病，是一种罕见却严重损害雄性生育能力的精子畸形的症状，表现为精液中含大量活动的精子尾部，却没有精子头部，无法和卵子结合，因此导致原发性不育症，其致病机理尚未阐明。

第一个发现并被证实的无头精子症的致病基因是SUN5，后续又发现了一个潜在的致病基因PMFBP1，这两种基因突变已经解释了70%患者的致病原因。2021年7月份，Frontiers in Cell and Developmental Biology(IF=6.684)刊文：“Pathogenic Variants in ACTRT1 Cause Acephalic Spermatozoa Syndrome”。文章报道了无头精子症的又一种致病基因——ACTRT1。该研究团队对34例无头精子症患者进行了全外显子组测序，并在2例患者中鉴定出了x-连锁基因ACTRT1的致病性变异。Sanger测序证实了这两个患者中ACTRT1的致病性变异。生物信息学分析表明两种致病性的ACTRT1变异都高度保守，且属于有害变异。ACTRT1基因敲除小鼠表现出和无头精子症类似的症状。因此，研究人员推测ACTRT1突变与无头精子症有关。该研究有助于临床医生和研究人员针对无头精子症开发新的治疗策略。

1.设置实验组和对照组，分别为34例无头精子症患者和30位健康男性。

2.用全外显子组测序筛选出变异基因，用Sanger测序进行验证。

3.用Papanicolaou染色法确定精子鞭毛的状态。

4.免疫印迹测定蛋白表达量。

5. 对ACTRT1突变患者进行辅助生殖。

6. 构建ACTRT1基因敲除小鼠模型。

在两例无头精子症患者中鉴定出ACTRT1 致病性变异

研究人员分析了34例无头精子症患者的WES数据，发现ACTRT1是其中2例患者(F018/II:3和F034/II:1)最可能的候选基因，随后进行了Sanger测序，以验证这两名患者及其家庭成员的ACTRT1突变。c.95G>A:p.Arg32His致病性变异在F018/II:3患者及其母亲(F018/I:2)、姐姐(F018/II:2)中检测到，姐姐的女儿为该变体的杂合子。然而该患者的父亲(F018/I:1)却携带野生型等位基因。在患者F034/II:1中也检测到致病性变异c.662A>G:pTyr221Cys。他的母亲是这种变体的杂合子，他的父亲携带野生型等位基因。两种致病性ACTRT1变异均具有相应的表现型，呈现孟德尔性状分离方式。

ACTRT1致病性变异的生物信息学分析

ACTRT1转录本(NM_138289.4)只有一个外显子，编码376个氨基酸的蛋白ACTRT1 (NP_612146.1)。这两个突变位点都出现在外显子中，并引起氨基酸替换。通过SIFT、polyphen2_hdiv、polyphen2_hvar和PROVEAN数据库进行预测分析，发现这两种变异均具有高致病性，gnomAD_genome数据库没找到这种变异的记录。此外，研究人员还评估了ACTRT1的进化保守性，对不同物种的factrt1的氨基酸序列进行了比对，最终发现受致病性变异影响的氨基酸在不同物种之间具有高度的保守性(图1C)。

利用SWISS-MODEL构建了突变的ACTRT1蛋白结构，致病性ACTRT1变异引起的氨基酸替换如图2A蛋白质三维结构所示。在患者F018/II:3中发现的致病变异导致ACTRT1的第32位的Arg被替换为His。类似地，在患者F034/II:1中鉴定的致病变体导致ACTRT1的第221个氨基酸Tyr被替换为Cys。这些变异可能会影响ACTRT1的三维结构，进而影响其稳定性和功能。

ACTRT1突变患者表现为无头精子症

研究团队对致病性ACTRT1变异患者进行了进一步详细的身体检查，发现所有患者外生殖器和双侧睾丸正常发育，在病人的双侧精索静脉未发现任何缺损，两例患者的染色体核型和激素水平均正常。采用Papanicolaou染色分析ACTRT1突变患者精子形态，对照组精子形态正常，头尾紧密相连。然而，大多数患者的精子是无头的，并且在低频率下观察到单头无尾(图3A)，因此被诊断为无头精子症。研究人员进一步分析了ACTRT1的表达和定位，通过与PCM1共染色，发现ACTRT1在对照组精子的PCM中高表达。然而，在感染患者的精子中，ACTRT1阳性染色脱位、弥漫(图3B)。

ACTRT1基因敲除的雄性小鼠表现出无头精子症

团队为了进一步证实ACTRT1在精子发生和头尾连接中的作用，使用CRISPR/cas9介导的基因编辑技术构建了一个ACTRT1敲除小鼠模型。PCR 和western blotting 结果证实ACTRT1在小鼠中被成功敲除。Hematoxylin and eosin染色显示ACTRT1敲除小鼠的精小管中精子发生正常，然而，ACTRT1基因敲除的小鼠大部分精子是无头的，进一步统计数据显示，ACTRT1敲除小鼠的精子约60%为无头精子，雄鼠的生育能力严重受损。团队使用ACTRT1敲除小鼠的精子进行Western blotting，发现Spata6的表达水平没有受到影响。而与无头精子相关的潜在基因Tsga10和Brdt的表达水平显著降低(图4B,C)。