文献分享 | 利用气体发酵法在工业中试规模中生产丙酮和异丙醇

摘要

    许多由化石资源生产的工业化学品可以通过发酵来实现可持续生产。这项工作中，作者描述了一种“碳负”发酵路线，从丰富的、低成本的废气原料，如工业排放和合成气，来生产工业上重要的化学品-丙酮和异丙醇。使用组合途径的方法，作者首先从前期收集的工业菌株库中挖掘出用于改造Clostridium autoethanogenum的高效酶。接下来，采用组学分析、动力学建模和无细胞表型设计来优化代谢通量。最后，对优化后的菌株进行规模化生产，其最高产率可达~3 g/L/h，产物选择性达~90%。生命周期分析证实，整个过程的碳排放量为负。区别于传统的化学品生产过程中会释放温室气体，这项工作的生产过程会固定碳。这些结果表明，改造后的C. autoethanogenumju可持续地、高效地和高选择性地生产丙酮和异丙醇。

   主要内容

图1. 途径、菌株和发酵过程的优化方法概述

1、合成路径优化

    为了扩大丙酮合成途径中硫醇化酶(ThlA)、CoA转移酶(CtfAB)和乙酰乙酸脱羧酶(Adc)的序列空间，作者挖掘了最近测序收集的272株ABE工业菌株(由奥塔哥大学大卫－琼斯收集，这里称为“DJ集合”)，在DJ集合中共鉴定了41种独特的、先前未报道过的丙酮合成途径酶(ThlA：6，CtfA：11；CtfB：13和Adc：11)，这些酶与参考菌株的酶具有72.4-99.8%的相似性。从鉴定的41种新酶中，作者选择了30种酶(ThlA: 4, CtfA: 6;CtfB: 10, Adc: 10;图2b)创建组合质粒文库。文库中包含酶突变体和三个不同强度的非重复性启动子(高、中、低活性)，通过调控酶的表达水平来优化丙酮的产量。研究者开发了一种分层方法，使用三个供体载体和一个表达载体，基于模块化和通用的pMTL80000载体系统，通过Golden-Gate组装和反向筛选以构建含有不同组合的文库(图2)。组合质粒在大肠杆菌中组装后，测序结果显示出良好的多样性，所有启动子和基因都存在且分布相对均。由于C. autoethanogenumju具有天然的短链醇脱氢酶(sAdh，CAETHG_0553)，可将丙酮还原为异丙醇，因此作者构建了一个sAdh敲除(KO) C. autoethanogenumju菌株（Δ0553），以便于文库的筛选。将上述质粒文库转化到Δ0553后，共获得247株具有不同丙酮生物合成途径组合的工程菌株并进行筛选。

    生长测试显示组合菌株的丙酮产量具有较大的多样性(最高达100 mM)。最佳组合为来自于ATCC824的硫解酶、CtfA Var8(DJ033；同源性为72.22%)、CtfB Var5 (DJ033；同源性为96.83%)和Adc Var1(在一系列DJ菌株中发现；同源性为75.72%)，该组合菌株用于后续的发酵测试和基因组整合。在优化丙酮途径后，作者在Δ0553中筛选了C. autoethanogenum sAdh库，测试其将丙酮转化为IPA的效率。结果显示，野生型sAdh和工程突变体S199A和S199R可将丙酮几乎完全转化（>97%），IPA含量可达20 g/L。

图2. 路径优化

a，丙酮和IPA生物合成途径；b，对DJ集合进行序列挖掘；c，组合文库组装策略；d，途径组合菌株中丙酮含量的测定。

2、菌株优化

    在确定了最佳的途径酶后，作者使用基因组尺度模型和进化算法来预测敲除某些特定基因后是否会增加到丙酮合成途径的代谢流，并消除不必要的副产物，特别是2,3-丁二醇（2,3-BPO）和3-羟基丁酸(3-HB)。该模型预测了增加丙酮合成通量的8个基因敲除目标，包括2，3-丁二醇合成途径中的乙酰乳酸脱羧酶反应（budA）。然而，该模型并未识别现有代谢网络中合成3-羟基丁酸的基因。因此，作者基于文献中描述的具有类似反应的酶进行了同源性搜索(图3a)。例如，在Cupriavidus中有一种3-HB脱氢酶(Bdh)能够将乙酰乙酸还原为3-羟基丁酸(3-HB)，这种活性将与乙酰乙酸脱羧酶(Adc)直接竞争。几个潜在的Bdh同工酶以及其他杂泛性的醇脱氢酶，包括乙醛脱氢酶或丁二醇脱氢酶，都存在于C. autoethanogenum基因组中。同样，对3-羟基丁酸（3-HB）的还原也可能在CoA水平上表现出来，如将乙酰-乙酰辅酶A转化为3-HB-CoA。硫酯酶也可能直接作用于乙酰辅酶A或乙酰乙酰基辅酶A，从而限制代谢流进入该途径或与辅酶A转移酶竞争，因此不能够提供能量转化。在C. autothanogenum基因组中，共鉴定了13个涉及3-HB合成的候选基因。

    考虑到在C. autoethanogenum中测试这么大的基因敲除组合是不太可行的，作者采用体外表征和快速优化生物合成酶(iPROBE)的方法。其概念是利用无细胞系统，通过评估增强单一靶向效应蛋白到丙酮合成的效果来加快工程宿主菌株的构建（在无细胞体系中过表达能够降低丙酮产率的候选基因，其敲除应能提高C. autoethanogenum的丙酮产率）。首先，作者使用无细胞基因表达(CFE)来创建一个单独富含丙酮生物合成酶和效应候选酶的细胞提取物阵列。接下来，将候选酶加入无细胞丙酮生物合成反应中，模拟候选基因过表达。然后在C. autoethanogenum中连续敲除iPROBE鉴定出的3-HB效应候选基因，以消除副产物并增加丙酮的产量。值得注意的是，作者对C. autoethanogenum组合菌株的蛋白质组学以及之前的RNA测序研究表明，并非所有候选基因都显著表达(图3c和附表5和表6)。其中，0420的表达可以忽略不计。因此，作者对基因0553、1586和1524进行顺序敲除。结果显示，Δ0553Δ1524中3-HB下降了5%，但三敲除菌株Δ0553Δ1524Δ1586中无法检测到3-HB (图3d和附图8)。同时，在这些敲除菌株中未观察到明显的负表型效应和生长速率降低。

    接下来，作者以2,3-丁二醇(2,3- BDO)途径通路为目标，通过敲除budA基因(CAETHG_2932)来验证基因组尺度模型的预测效果。结果显示，在合成菌株Δ0553Δ1524Δ1586Δ2932::Pfer-thlA-ctfAB-adc中，丙酮产量从小于2 mol %增加到大于50 mol %，含量增加了27倍，副产物只有乙酸和乙醇。

图3. 菌株优化

    此外，作者对组合文库中的10株菌株进行了蛋白质组学测定，总共检测到1,914种不同的蛋白，其中丙酮合成途径酶的丰度均最高，占到3.2%。统计分析表明，丙酮产量与丙酮途径相关酶的丰度有良好的相关性，在丙酮产量最低的菌株中酶的丰度最低。作者还发现，与ThlA和Adc相比，CtfAB的两个亚基的表达水平相对较低（即使是由最强的启动子驱动）。随后，按照最近描述的方法，作者利用不同的动力学参数设计了一系列产丙酮C. autoethanogenum菌株。通过模拟与中枢代谢和丙酮途径相关酶的表达水平变化，该模型预测过表达CtfAB会增加丙酮通量。此外，作者利用之前的体外表征和快速优化生物合成酶(iPROBE)系统，通过不同丙酮途径酶的差异表达水平来验证这一假设，并证实了增加CtfAB的丰度可以最大程度地提高丙酮产量。因此，作者在菌株Δ0553Δ1524Δ1586Δ2932:: pfe-thla-CtfAB-adc(-sAdh)基础上，引入过表达CtfAB的或者在基因组增加了第二个CtfAB拷贝来提高其蛋白质丰度，从而使丙酮/IPA选择性提高40%以上。

3、发酵过程优化

    接下来，作者将从组合文库筛选的最佳质粒引入C. autoethanogenum菌株，并在台式连续搅拌槽反应器(CSTR)中建立了丙酮的连续发酵过程。发酵过程显示，在发酵性能下降前12天是一个平稳的状态，发酵产物主要为乙醇和丙酮，次要产物为乙酸、2,3-丁二醇和对3-羟基丁酸（3-HB）。基因组整合菌株Δ0553Δ1524Δ1586Δ2932::Pfer-thlA-ctfAB-adc显著提高了丙酮的选择性和培养稳定性，检测结果显示，丙酮产率为~2.5 g/L/h，气体利用率为~80% (图4d)。

    此外，在丙酮生产工艺基础上，作者研究了其工艺是否会转化为IPA生产的可能性。在已开发的丙酮工程菌株的背景下添加丙酮后进行了测试，结果显示， S199在IPA生产中表现出最高的产量和稳定性。在发酵方案稍作调整优化后，基因组整合菌株Δ0553Δ1524Δ1586Δ2932::Pfer-thlA-ctfAB-adc-sAdh表现出与之前构建的丙酮工程菌株相似的效果，气体利用率为85%，IPA的生产效率最高可达3 g/L/h（图4d）。此外，研究发现对于丙酮和IPA生产菌株，CtfAB拷贝数增加一倍后，进一步提高了CSTR的性能，可达到90%的选择性(图4a,b)

    鉴于构建的C. autothanogenum成功实现了丙酮和异丙醇的异源生产，作者将这两种工艺均按60倍的比例从实验室到现场试验进行放大，这包括从2 L台式CSTR过渡到使用回路反应器的120 L中试装置(图4c)。在相似的发酵条件和气体组成下，对菌株Δ0553Δ1524Δ1586Δ2932::Pfer-thlA-ctfAB-adc(-sAdh)进行了几次测试反应。结果显示，在连续培养条件下，就产品选择性、生产率以及中试反应器的稳定性而言，菌株在回路反应器120 L中试装置的表现与在基于CSTR的台式发酵的表现密切相关(图4d)。

图4. 发酵过程优化和规模化

 

    最后，作者利用生命周期分析(LCA)对使用放大气体发酵工艺生产和目前以化石原料为基础的通过丙烯和异丙苯工艺生产丙酮和IPA等产物进行了比较(图5a)。根据中试规模数据和工业规模乙醇生产的设计数据（例如电力和蒸汽）测试了化学和能源投入和产品产量。结果显示，气体发酵过程产生丙酮和IPA的温室气体排放分别为−1.78 kg CO₂e/kg acetone和−1.17 kg CO₂e/kg IPA(图5c)。负值是由于避免了尾气排放，同时工艺排放较低(图5c)，能有效地将CO2固定在产品中。相比之下，传统的化石原料生产路线会导致大量的温室气体排放(2.55 kg CO₂e/kg acetone和1.85 kgCO₂e/kg IPA)。

图5. 生命周期分析

 

总结

    作者以C. autothanogenum为出发菌株，依靠路径优化、菌株优化和工艺开发方面的创新，探索了丙酮和异丙醇生物合成基因的最大序列空间，以确定最优路径设计。通过挖掘大规模工业菌株基因组集，并筛选了数百种设计的组合文库，从而显著提高了丙酮和异丙醇的生产水平。最后，对优化后的菌株在120 L回路反应器的中试装置中进行规模化生产，其产率可达~3 g/L/h，选择性可达~90%。生命周期分析证实，相比传统的化石原料生产路线会导致大量的温室气体排放，该气体发酵过程产生丙酮和IPA的温室气体排放为负值。这些结果表明，改造后的C. autothanogenum可持续地、高效地和高选择性地生产丙酮和异丙醇。该研究成果不仅具有广泛的应用前景，也为利用工程菌以二氧化碳为原料生产其他化合物奠定了基础。