(文献解读:刘璐)花鲈水通道蛋白(aqps)的全基因组表征:淡水驯化过程中的进化和表达模式

Marine Biotechnology：花鲈水通道蛋白(aqps)的全基因组表征：淡水驯化过程中的进化和表达模式

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导读

水通道蛋白(aqp)蛋白是一组小的完整膜蛋白，作为水和其他小溶质跨细胞膜运输的孔道起着至关重要的作用。在我们的研究中，我们从花鲈(Lateolabrax maculatus)基因组数据库中鉴定了17个aqp基因。进行基因组织、基序分布和选择压力分析以研究它们的进化特征。aqp mRNA在十个选定的健康花鲈组织中显示出组织特异性表达模式。为了研究花鲈aqps在渗透调节中的潜在参与，在淡水 (FW) 驯化过程中使用 qRTPCR 检查了鳃中aqp基因的表达谱。aqp3a的mRNA水平在FW过渡期的1-3天被显著诱导（在第1天和第3天比对照组上调77倍和15倍），表明aqp3a在花鲈中的低渗调节作用中可能发挥重要作用。此外，aqp1aa、aqp1ab、aqp3b、aqp7和aqp9b的表达水平在转入FW后1天都有不同程度的增加，表明它们可能参与了FW的驯化过程。我们的研究为未来的研究提供了宝贵的基础，旨在揭示aqp基因在斑点鲈鱼和其他硬骨鱼类的盐度适应过程中的具体作用。

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文章信息

标题：Genome-Wide Characterization of Aquaporins (aqps)in Lateolabrax maculatus: Evolution and Expression Patterns During FreshwaterAcclimation

期刊：Marine Biotechnology

第一作者：Xiaoyan Zhang；通讯作者：Chao Li

单位：School of Marine Scienceand Engineering, Qingdao Agricultural University

First published：30 September 2021

DOI：10.1007/s10126-021-10057-0

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前言

为了在不同盐度的水生环境中维持正常的生存和生长，鱼类进化出了复杂的离子/渗透调节机制来维持稳定的内部体液稳态，这主要是由一组器官实现的，包括鳃、肾脏和肠道。鳃是鱼类中研究最广泛的渗透调节器官，起着至关重要的作用，尤其是在离子调节和水运输中。历史上，跨细胞水运输被认为是通过脂质双层的简单扩散发生的。然而，由于观察到人类红细胞和青蛙的膀胱增加了水渗透，人们认为运输是在主要内在蛋白质家族的帮助下发生的，特别是水通道蛋白( aqps )，它被认为是细胞的管道系统。

AQP是小的完整膜蛋白，它选择性地控制水和其他小分子通过生物膜的流动。aqps在许多生物的渗透调节中发挥重要作用，尤其是水生生物。第一个aqp是从牛晶状体纤维膜中发现的，并报告为aqp0。从那时起，已经鉴定了许多aqp基因，并且越来越多的aqp全基因组分析已经发表。迄今为止，脊椎动物总科包含17个aqp旁系同源物( aqp0–aqp16 )，并且在植物中报道了多达71个aqp相关序列。已经揭示了aqps在哺乳动物和植物中的重要性，并且它们的生理学和病理生理学已经很好地建立。

硬骨鱼面临着与周围水生环境直接相互作用的挑战，预计aqps将发挥重要作用。鱼类中aqp的第一份报告出现在2002年，当时aqp3b是从欧洲鳗( Anguilla anguilla )的鳃中克隆出来的。迄今为止的证据表明，硬骨鱼类的基因组拥有大量编码aqps的基因。所有aqp基因具有相对保守的分子结构；六个跨膜段（TM1-TM6）和五个连接环（LA-LE）。每个aqp包含一个保守的天冬酰胺 ± 脯氨酸 ± 丙氨酸 (NPA) 基序，它们位于环B和E处，形成短的疏水螺旋并从相对的两侧浸入膜的中途，彼此面对并参与底物选择性。

广盐性鱼类物种是研究aqp基因调节的理想模型，因为它们持续需要维持渗透稳态。花鲈（Lateolabrax maculatus）是中国最重要的广盐性硬骨鱼类之一，可以适应从全淡水（0 ppt）到45 ppt海水的各种盐度环境。在这种情况下，花鲈可能是研究aqps在生理适应环境盐度中的作用的绝佳模型。为了深入了解aqps在渗透调节中的功能参与，我们筛选了花鲈基因组以识别aqp序列。进一步的系统发育和同线分析证实了基因注释和命名法。分析了aqp基因的组织分布，并检测了淡水 (FW) 驯化过程中鳃 mRNA 表达的变化。

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结果

1. 花鲈aqp基因的鉴定

从花鲈的基因组和转录组数据库中共鉴定出17个aqp基因。各种aqp基因首先根据对多种鱼类（包括斑马鱼、鲶和欧洲鲈）的BLAST结果进行命名。保守域结果表明花鲈中的所有aqps都包含一个主要的内在蛋白 (MIP) 域，这被认为是aqp家族的特征（表1）。花鲈aqps的 ORF长度为 783-1113 bp，编码 246-370 个氨基酸的蛋白质。它们的相对分子质量从 26.73 到 39.49 kDa 不等。此外，表1总结了 NCBI 的等电点和登录号等附加信息。

2. aqp基因的系统发育分析

进行系统发育分析以确认花鲈aqp基因的注释。花鲈和其他代表性脊椎动物物种，包括人、斑马鱼、虎河豚和日本青鳉的aqp基因的氨基酸序列被用于检查系统发育关系（图1）。总体而言，花鲈aqps被放置在相应的进化枝中，该进化枝包含来自具有强大引导支持的其他物种的对应物。与先前在脊椎动物中的研究一致，花鲈aqp基因因此根据系统发育关系分为四个亚科：亚科 I 包含aqp0、aqp1和aqp4，被称为“经典水通道蛋白”，（大部分）只透水；亚家族 II 由两种非正统的水通道蛋白（aqp11和aqp12）组成；水和甘油转运蛋白或水甘油孔蛋白（Glps；aqp3、aqp7、aqp9和aqp10）被归类为亚家族 III；亚科 IV 包括一个单一的aqp8拷贝，它是一种水和尿素转运蛋白。系统发育分析为花鲈中aqp基因的注释和进化关系提供了证据。

图1 花鲈aqp基因的系统发育分析。系统发育树是通过邻接法在 MEGA7 中使用 1000 次 bootstrap 复制构建的。花鲈的aqp基因用红点标记，重复的直系同源物用彩色星标标记。系统发育树被分为四个亚科，不同颜色的覆盖线

 

3. aqp基因的基因拷贝数分析

确定了花鲈和其他脊椎动物中aqp基因的拷贝数，并总结在表2 中。与其他硬骨鱼一致，aqp2、aqp5和aqp6在花鲈基因组中不存在。几个斑点鲈鱼aqp基因，包括aqp0、aqp1、aqp3、aqp8、aqp9、aqp10和aqp11，一式两份；因此，这些生物比高等脊椎动物多一个基因拷贝。剩余的aqp斑点鲈鱼的基因存在于单个副本中，包括aqp4、aqp7和aqp12。在哺乳动物中，最高拷贝数在人类中发现，具有多达 17 个aqp旁系同源物，而在具有映射基因组的 5 个选定硬骨鱼中的aqp基因数量在 16 到 21 个旁系同源物之间。值得注意的是，aqp8基因的扩增在硬骨鱼中很常见。相比之下，aqp12在哺乳动物中复制了两次，但只有一个aqp12在测试的硬骨鱼中发现了基因。值得补充的是，基因复制在硬骨鱼（相对于高等脊椎动物）中很常见，它源自硬骨鱼谱系开始时的硬骨鱼特异性全基因组复制（WGD）。这可以解释为什么硬骨鱼通常比高等哺乳动物具有更多的基因拷贝数。

4. 花鲈aqp基因的染色体分布及同线分析

在硬骨鱼特异性基因复制事件、同源重组或其他复杂进化过程的事件条件下，来自同一基因的旁系同源拷贝在外观上很常见。为了进一步证实花鲈中重复aqp基因（aqp0、aqp1、aqp3、aqp8、aqp9、aqp10和aqp11）的注释，进行了同线分析以比较斑马鱼中aqp基因的相邻遗传区域，虎河豚和花鲈（图 2）。结果表明aqp花鲈中的基因与斑马鱼和虎河豚共享一个保守的基因组邻域，证实了重复aqp基因的注释。

图2 斑马鱼、虎河豚和花鲈中aqp簇的同线分析。AG 分别代表对aqp0、aqp1、aqp3、aqp8、aqp9、aqp10和aqp11基因的分析。该水通道蛋白的基因均标有颜色填充盒。基因的全名列在补充表S2中。

 

17个aqp基因分布在14条染色体上，如图3中黑线所示。三个aqp基因（aqp1aa、aqp1ab和aqp4）位于 10 号染色体上，两个基因位于 9 号染色体上（aqp0a和aqp0b）。其他 12 个基因分别位于不同的染色体上（图 3）。通过将每个直系同源物的位置信息与染色体同线性分析相结合，我们能够推测重复基因是通过 WGD 产生的还是与染色体内重复有关。因此，我们注释每一个与后记的“a”或“b”的硬骨鱼旁系同源以反映基因组重复，如aqp8a和aqp8b，位于分别CHR 15和CHR21; 许多共线片段表明染色体是通过 WGD 产生的。此外，我们发现了一个串联重复事件，它立即并列在花鲈 (Chr10) 的基因组中。因此，我们将它们标记为aqp1aa和aqp1ab以匹配斑马鱼术语以保持一致性。

图3 花鲈aqp基因的染色体位置和复制模式。条形上的黑线表示每个aqp基因的位置。基因组同线性以灰线显示，aqp旁系同源物的同线性关系以不同颜色的线表示。圆环表示染色体中基因的密度。

 

5. aqp基因的基因结构分析

推测的花鲈的 Aqp 氨基酸包含由五个环 (A ~ E) 连接的六个跨膜 α-螺旋和两个高度保守的 NPA 盒，它们形成构成底物选择性孔的短疏水螺旋（图4A和5）。通过AQP，水和其它密切相关的分子的单链多肽可进入和离开细胞的比通过磷脂双层（图扩散更迅速地流过 4 B）。通常情况下，蛋白质AQP嵌入在细胞膜作为四聚体形成四个水分子或其它小分子途径（图 4 C）。三级结构呈沙漏状，芳香残基/精氨酸（ar/R）收缩区是另一个重要的过滤区，显示了水选择性和甘油转运aqp之间的差异（图 5）。水选择性aqp1aa 中的该区域由四种氨基酸组成，包括苯丙氨酸 (Phe)、组氨酸 (His)、半胱氨酸 (Cys) 和精氨酸 (Arg)，形成疏水性和大小过滤器，而甘油中的 His 和 Cys 残基-转运 aqp3a 的蛋白分别被甘氨酸 (Gly) 和酪氨酸 (Tyr) 替代（图 5）。这导致 ar/R 区域更宽且疏水性更强，从而允许多元醇和尿素以及其他小溶质（如 NH₃）通过、CO₂或 O₂ 。

图4 A示意图为花鲈氨基酸序列比对水通道; 在α-螺旋区域（H1-8）内发现了最高的残基相似性。跨膜域 (TMD1-6) 被注释为 Aqp1aa。B示意图显示了 Aqp 分子 - 蛋白质通道，允许水快速大量运动。C四聚体由四个单体组装而成。以小鼠Aqp晶体结构为模板，使用PyMOL 1.3软件显示

图5 花鲈的A水选择性水通道蛋白 (Aqp1aa) 和B水甘油通道蛋白 (Aqp3a) 的预测三维结构（左前视图和右顶视图）。保守的NPA基序用棒状和球状表示，ar/R残基用球形表示，并根据氨基酸位置进行标记。

 

在花鲈的aqps 中共鉴定出 10 个基序（图 6）。每个基序的长度范围为 21 到 50 个氨基酸。根据 InterProScan 的预测，基序 1、2、3、5、6 和 7 被认为是跨膜转运基序。来自同一亚科的基因表现出相似的基序特征（图 6）。详细地，在所有推导出的 aqps 蛋白质中共享基序 1。基序 4、基序 2 和基序 10 仅在亚科 III 中发现，而基序 7 似乎是亚科 I 特异性的。

 

在花鲈中鉴定出的 17 个aqps中观察到了不同的外显子-内含子结构，外显子数从 2 到 6 不等（图7）。与基序分布模式相似，来自同一亚科的aqp基因具有相似的外显子-内含子结构。除了具有五个外显子的aqp10a外，亚家族 III 中的成员包含最多数量的 6 个外显子。亚家族 III 包含的外显子数量最多，该亚家族中的所有aqp基因都包含六个外显子，但aqp10a只有五个外显子。I亚科的大部分基因有4个外显子，其中aqp4比其他成员多一个外显子。对于亚科 II，所有三个aqp基因有三个外显子。此外，在亚科 IV 中，外显子的数量存在显著差异，范围从 5 到 2。

 

6. 花鲈aqp基因氨基酸位点的选择性压力分析

基于分支位点模型的选择性压力分析允许可靠检测单个氨基酸位点和沿进化谱系的正选择。在我们的研究中，为了探索在进化过程中经历正选择的地点，人类、鸡、老鼠、牛、斑马鱼、花鲈、大西洋鲑和热带爪蛙的每个亚科被用作前景谱系来计算ω (dN/ dS)（表3 和补充图 1）。似然比检验 (LRT) 表明模型 A 拟合数据显著优于模型 A null ( P < 0.05) 在亚家族 II、III 和 IV 中。模型 A 分别表明亚家族 II、III 和 IV 中aqp基因位点的 34.6%、45.3% 和 52.7% 的阳性选择。在后验概率 (P) > 95% 的水平上，沿着亚家族 II、III 和 IV，有 5 个位点可能处于正选择之下。这些积极选择的位点是 6P、32Y、48Y、62Q 和 75C。详细信息列于表3 中。

7. aqp基因在各种组织中的表达模式

用 qRT-PCR 分析了 10 种健康花鲈组织中aqp基因的组织分布，包括肾脏、性腺、胃、肠、鳃、肌肉、心脏、脾脏、肝脏和大脑。如图8所示，aqp基因表现出组织特异性表达模式。一些花鲈aqp基因，如aqp1aa和aqp1ab，在不同组织中表现出广泛的表达。同一亚家族内的基因，甚至不同的基因变体，表现出不同的表达模式。例如，与aqp11b几乎在各个组织中广泛表达不同，aqp11a仅限于性腺和大脑，在大脑中的表达相对较高，表明两个aqp11副本在花鲈中发挥了不同的生理功能。对于渗透调节器官，aqp1aa、aqp1ab、aqp3a、aqp3b、aqp7、aqp8b和aqp9b在鳃中表达。在肾脏中，aqp1aa、aqp4、aqp8a、aqp8b和aqp12高表达，而aqp8a、aqp8b、aqp9b和aqp10a 在肠道中高度表达。

图8 花鲈aqps在各组织中的表达谱。十种不同的组织包括肾、性腺、胃、肠、鳃、肌肉、心脏、脾、肝和脑。每个aqp基因名称都标记在右侧。aqp基因表达的log 2值用于创建热图，颜色越暖表示表达越高。

 

8. FW驯化过程中aqp基因鳃表达模式的分析

为了研究在淡水驯化过程中aqp基因在花鲈中的参与，通过 qRT-PCR 测量了鳃中的转录水平（图 9）。根据上述组织分布分析结果，筛选出7个鳃中表达水平显著的aqp基因（aqp1aa、aqp1ab、aqp3a、aqp3b、aqp7、aqp8b和aqp9b）进行mRNA检测。一般来说，转移到 FW 后，所有测试的aqp基因的 mRNA 表达水平在第 1 天增加，在第 3 天后下降。（图 9）。值得注意的是，aqp3a的鳃表达在转移到 FW 时显著高度诱导，与对照组相比，第 1 天的表达水平高 77 倍。aqp3a的表达在第 3 天降低到 15 倍，并在第 7 天恢复到正常水平。mRNA 表达谱表明aqp3a可能在花鲈 FW 适应过程中的渗透调节中发挥重要作用。此外，aqp1aa、aqp1ab、aqp3b、aqp7和aqp9b的表达水平在转入FW后第1天有不同程度的增加（图 9）)，表明他们可能参与 FW 驯化过程。

图9 FW驯化过程中7个选定的花鲈aqp基因在鳃中的表达。采用定量RT-PCR法测定转鱼后4个采样时间（0天、1天、3天、7天）下鳃的表达情况。x 轴提供了相关基因的名称。18S rRNA 用作内部参考。结果显示为平均值±标准误差（条形）。对照和不同时间点之间的显著性差异（P < 0.05）用不同的字母表示。

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总结

在花鲈中鉴定并注释了17个aqp基因。系统发育和同源性分析结果表明，花鲈aqp基因存在串联排列和重复事件。此外，还发现在亚科II、III和IV的进化枝上出现了5个正选择位点，这可能解释了亚科之间功能和膜定位的差异。基因表达谱表明aqp3a可能在 FW 驯化过程中在花鲈鳃的渗透调节中发挥最重要的作用。我们的研究不仅加深了对aqp的理解基因，但也为未来研究aqp基因响应盐度适应的生理学和分子机制提供了宝贵的基础。

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参考文献

Zhang,X., Yu, P., Wen, H. et al. 2021. Genome-Wide Characterization of Aquaporins(aqps) in Lateolabrax maculatus: Evolution and Expression Patterns DuringFreshwater Acclimation. Mar Biotechnol.