不依赖模板直接合成RNA!Wyss研究所拟优化RNA合成技术,解决化学合成难题

发布于 2021-10-12 19:32



多年来，生物制药市场一直以针对细胞蛋白质的小分子药物为主，然而，大多数小分子药物还是无法成功开发进入市场。在近几十年中，RNA 领域的突破性研究推动 RNA 疗法的发展。

图 | 目前已上市的不同类别 RNA 药物（来源：GENE ONLINE）

RNA 药物优于小分子药物的特点在于它们可以直接与 mRNA 结合并造成其降解，从而防止致病蛋白质被转录，其次它们可以轻易与现有疗法合并使用。

RNA 疗法的机理是使用能够与 mRNA 通过碱基配对结合的寡核苷酸来影响 mRNA 的代谢过程，包括从 mRNA 前体（pre-mRNA）开始的 mRNA 剪接和成熟过程，mRNA 的运送，根据 mRNA 进行的蛋白转译，以及 mRNA 的降解过程。目前 RNA 疗法可以分为 siRNA（小分子干扰核糖核酸）和 ASO（反义寡核苷酸）两大类型。

图 | mRNA 疗法示意图

ASO 和 siRNA 有很多不同之处，首先 ASO 是单链 siRNA 是双链；其次因为单双链结构的差异，siRNA 的亲水性更好也因此需要用脂质体能纳米载体递送而 ASO 主要还是通过化学修饰递送；在应用上 ASO 可以用于更多不同的靶器官而 siRNA 主要还是肝脏。

图 | 单链和双链寡核苷酸结构（来源：研究论文）

近年来，RNA 相关研究发展迅速，因此从质和量两方面对 RNA 合成技术提出了更高的要求。RNA 合成方法包括化学合成和酶法合成两种。

RNA 的化学合成是按照 3' → 5' 磷酸二酯键的方向依次连接核苷酸，需采用特定的化学试剂对相应的基团进行适当的加保护和去保护来完成。

1955 年，英国剑桥大学 Todd 实验室采用磷酸二酯法合成了寡聚二核苷酸，正式拉开了核酸化学合成的序幕。然后核酸化学合成法经历了磷酸三酯法、亚磷酸三酯法。最终发展为现在的固相亚磷酸三酯法（DNA 柱法合成）。历经 30 多年，核酸化学合成已实现了自动化，可满足长度小于 90 个碱基的 RNA 合成。化学合成可以实现 RNA 的化学修饰，目前仍是一种广泛应用的 RNA 合成方法。

图 | 用亚磷酸三酯法缩合成甲乙二核苷酸

不过 RNA 化学合成也存在很多问题。由于核糖核苷糖环的 2'-OH 和 3'-OH 反应活性近似，导致特定官能团加保护和去保护困难，合成收率随序列长度增加而显著降低；化学合成需要采用固相合成法，合成规模难以扩大，无法满足核酸类药物的研发与制备需求；化学法合成 RNA 的过程中需使用大量化学试剂，原子经济性差，不符合绿色环保的理念。
由 George Church 博士领导的 Wyss 研究所合成生物学平台的一个研究团队正在开发一种新的基于酶的、不依赖模板的 RNA 寡核苷酸合成技术 (eRNA)，以解决当前传统化学合成的局限性。
图 | George Church（来源 wyss 官网）

他们使用一组专有工程酶和新型核苷酸构建模块，以高效的方式生产由天然和非天然碱基组成的准确、高质量的 RNA 寡核苷酸序列，从而减少之后反应的纯化步骤。
该方法除了在水性反应条件下 “绿色” 合成寡核苷酸，还有可能合成高度定制化且显着更长的 RNA 寡核苷酸。
通过新开发的阻断策略，合成系统可以严格控制 RNA 寡核苷酸链每一步的核苷酸添加，从而大大提高合成的整体准确性 —— 传统方法容易积累过早的截断产物、核碱基脱嘌呤、和插入 / 删除。

重要的是，这种控制水平还能够在特定位置引入修饰的寡核苷酸 —— 这是迄今为止许多 RNA 疗法无法做到的。

一般的酶法合成需要模板，只能先合成 DNA 再合成 RNA，但如果模板受限，将无法继续，Wyss 开发的是不依赖模板的酶法合成，通过控制加的酶来实现合成任意序列的 RNA。优势是可以大量合成，只要体积足够大就可以满足合成需要，但问题是必须保证前面的酶都消耗掉，否则也要分离提纯，因此大量合成也需要解决酶的回收问题。
参考文献：

  • https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413118301827

  • 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.008


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