【文献解读】鳗弧菌和杀鲑气单胞菌无色亚种二价疫苗对大菱鲆健康和存活的影响

       

                     

本文分析了腹腔注射一种油基二价自体疫苗和市售疫苗AlphaJect 3000预防大菱鲆非典型疖肠病和弧菌病的疗效。试验了两种疫苗对鳗弧菌( Vibrio anguillarum)和杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subspecie achromogenes)攻毒后鱼类健康参数和存活的影响。自体疫苗以单剂量给予两种病原体高水平的保护和持久免疫；然而，注射这种疫苗的大菱鲆出现了严重的副作用，而注射AlphaJect3000疫苗和佐剂Montanide或Eolane的副作用较小。所有接种鱼均表现出显著的抗体凝集效价。

1.实验设计和疫苗接种策略如图1所示

图1.实验设计(a)、疫苗接种策略和采样程序(b)。

2.结果

2.1疫苗接种的表现和组织学效应

通过目测和组织学分析评估了用自体和商业油佐剂疫苗和佐剂免疫大菱鲆的副作用(表1)。在接种大菱鲆自体疫苗(Ss = 5.65±0.75)和商业疫苗(Ss =4.45±1.05)或注射佐剂Montanide(Ss = 2.60±0.99)后45 d，记录到腹腔的最高损伤程度，显著高于疫苗对照组 (p < 0.005)。在注射了佐剂Eolane的鱼中检测到轻度或轻微粘连(Sc = 0.68±0.95)。在接种了自体疫苗(Ss =5.50±0.53)的鱼中，160 d后观察到了类似的结果(表1)，而在接种了一剂(Ss = 2.50±1.07)或两剂(Ss =3.88±0.35)的AlphaJect3000疫苗或注射了PBS:佐剂混合物(Ss =0.40±0.97)的鱼中，观察到了最低的Ss值。

表1.鱼处理后的宏观和微观效果。结果以平均标准偏差表示

G1，对照组；G2，注射Montanide的鱼；G3，注射Eolane的鱼；G4，用自体疫苗免疫的鱼；G5和G6，分别用一剂、两剂AlphaJect 3000疫苗免疫的鱼。半定量表:无病变(0)、低(1)、中等(2)和严重(3)。

大多数组肝脏样本的组织学检查显示与肝浆膜相关的炎性肉芽肿反应(图2)，包括厚纤维包膜和空核心肉芽肿，以及疏松的纤维组织和混合炎性浸润。只有注射PBS的鱼在这个区域没有出现肉芽肿反应。注射了佐剂(Montanide和Eolane)、商业疫苗和自体疫苗的鱼显示局灶性或多发性肉芽肿结构(病变强度范围为0.13±0.23至0.94±0.56)，与肝浆膜相关，偶尔与外分泌胰腺相关。在这些病例中，在与肝浆膜或外分泌胰腺组织接触的肝实质中没有检测到损伤或改变。

图2.肝脏切片的高倍照片(40×)显示内脏周围肉芽肿反应(箭头)的发生率不一。外分泌胰腺的腺泡细胞用(*)表示，对应于这一特定特征的组织学评分显示在每个切片的右下角。染色:苏木精和伊红。

还观察到肝细胞胞浆内空泡化，病变强度不同(数值范围为1.75±0.53至2.0±0.65)。这些迹象更可能与食物摄入的差异有关，而不是疫苗注射因素。在肝实质、肾脏和心脏样本中检测到轻微的、非特异性的组织病理学体征，但未检测到与疫苗或佐剂注射明显相关的其他体征。

2.2.生理参数的评估

健康参数评估的结果如表2所示。处理45 d后，接种大菱鲆疫苗的鱼的平均体重为71.0±14.0 g至88.0±16.0 g，注射佐剂的鱼的平均体重为94.0±16.0 g至106.0±17.0g。相对于对照鱼的数值(94.0±17.0 g)，未观察到该参数有显著差异(表2)。接种了自体疫苗(10.7±1.8%)和商业疫苗(7.6±0.9%)的大菱鲆的内脏指数(VSI)值显著高于接种了Montanide (6.4±0.8%)、Eolane (6.4±0.9%)或PBS(6.0±1.1%)的鱼(表2)。接种了自体疫苗的大菱鲆的肝体指数(HIS)(0.7±1.1%)(p < 0.05)明显低于接种了商业疫苗(2.2±0.3%)、Eolane(2.0±0.4%)、Montanide(2.0±0.3%)或PBS(1.8±0.3%)的鱼(表2)。免疫后160 d，HSI治疗组之间没有观察到差异。接种自体疫苗的大菱鲆体重明显小于注射Eolane 130(339.5±73.0 g)或PBS(304.8±55.0 g)的鱼(表2)。在关于VSI的处理之间也观察到差异(p< 0.05)，这在用自体疫苗接种的鱼中显著更高(表2)。

表2.鱼处理后的健康参数

VSI，内脏指数=[内脏重量(克)/身体重量(克)]×100；HSI，肝体指数=[肝重(g)/体重(g)]×100；血细胞比容通过离心技术测定，结果以百分比报告。SI:刺激指数=刺激白细胞的几何平均荧光强度/未刺激白细胞的几何平均荧光强度。同一列中上标(a，b)不同的数据方差分析显著不同(p < 0.05)。

用灭活的杀鲑气单胞菌无色亚种和鳗弧菌的全细菌细胞作为抗原，通过测量接种后45 d和160 d的血清凝集抗体滴度来评估用自体疫苗和AlphaJect 3000疫苗免疫的大菱鲆的特异性免疫应答。只有来自用自体疫苗和商业疫苗免疫的鱼的血清显示出与两种病原体的抗原的特异性凝集(表3)。只有在用自体疫苗免疫鱼45 d后，才记录到显著(p < 0.05)更高的抗杀鲑气单胞菌无色亚种的凝集抗体滴度值。在接种后45 d，用自体疫苗和商业疫苗免疫的鱼中观察到针对鳗弧菌抗原的相似滴度值。在接种后160 d，只有接种了单剂自体疫苗或两剂商业疫苗的鱼对气单胞菌和弧菌抗原保持显著的抗体滴度。

表3.大菱鲆血清凝集试验结果

治疗后45 d和160 d；结果用每次处理6条鱼的样本表示为凝集点的平均标准偏差

2.3.疫苗的功效

接种后45 d的感染性挑战结果显示，接种油基自体疫苗(G4组)和alphaJect 3000(G5和G6)疫苗的大菱鲆用鳗弧菌进行静脉注射后得到完全保护(RPS = 100;表4)。然而，只有自体疫苗(G4)对大菱鲆杀鲑气单胞菌无色亚种具有高水平的保护作用 (RPS = 83%)。接种疫苗后160 d，用一剂(G5)或两剂(G6) Alphaeject3000疫苗免疫的鱼(RPS = 52-60%)和用单剂自体(G4)疫苗免疫的鱼(RPS = 67%)都获得了对鳗弧菌的中度保护。相比之下，用杀鲑气单胞菌无色亚种攻击后保护水平增加。在接种一剂(G5，RPS = 77%)或两剂AlphaeJect 3000(G6，RPS = 100%)或单剂自体疫苗(G4，RPS = 100%)的大菱鲆中观察到杀鲑气单胞菌无色亚种。接种疫苗组(免疫后45 d和160 d受到攻击)和相应对照组的最终死亡率之间存在显著差异(p < 0.05)。

表4.在实验室条件下在大菱鲆中进行的二价疫苗和接种程序的效力

RPS60，相对存活率60% = (1-M/60) × 100

注射佐剂MontanideISA 763A VG和Eolane 130对鳗弧菌和杀鲑气单胞菌无色亚种攻击后鱼存活的影响(表4)。注射了Montanide (ISA 763A VG)的鱼在用鳗弧菌攻击后显示出低保护值(G2，RPS =38%)。注射了佐剂Eolane 130 (G3)的鱼也获得了类似的结果(表4)。统计分析显示，在接种疫苗后45 d，注射佐剂的组(G2和G3)和注射PBS的对照组(G1)的最终累积死亡率之间存在显著差异(p < 0.05)。相比之下，注射了这两种佐剂的鱼显示出对杀鲑气单胞菌无色亚种的高保护水平。在大多数情况下，注射佐剂160 d后，这些保护水平(RPS)会降低(对于杀鲑气单胞菌无色亚种，RPS值在0%至55%之间。鳗弧菌为5%-7%；表4)。

3.结论

本研究中开发的油基自体二价疫苗，在大菱鲆单剂量给药后，对非典型疖病和弧菌病提供了高水平的长期保护，但对鱼产生了高副作用。因此，进一步的研究应该集中在自体疫苗和其他佐剂的评估，以减少或没有副作用并提高保护。从这个意义上说，本研究中评估的油基佐剂Eolane 130是大菱鲆的一种耐受性良好的佐剂，可以在未来的疫苗开发中加以考虑。

参考文献

【1】Torres-Corral Y, Girons A, González-Barreiro O,et al. Effect of Bivalent Vaccines against Vibrio anguillarum and Aeromonassalmonicida Subspecie achromogenes on Health and Survival of Turbot[J].Vaccines, 2021, 9(8): 906.

DOI：10.3390/vaccines9080906

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